真菌毒素被認為是食源性疾病的最重要原因之一，并受到全球范圍內的長期關注。隨著公共衛生意識的提高，一些組織已經為食品中的真菌毒素設定了最大殘留限度（MRLS），以避免高風險行為。然而，大多數真菌毒素以微量的形式存在，對食品安全構成了嚴重威脅。此外，存在于同一食品中的多種毒素的協同或拮抗作用增加了對人和動物的毒性。而面對物流全球化的發展趨勢，傳統的真菌毒素分析方法如高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜-質譜法（LC-MS）由于程序復雜、設備笨重、操作復雜，在一定程度上限制了其實際應用。因此，建立和開發針對多種真菌毒素的靈敏、快速、準確的高通量檢測方法，以滿足食品質量安全的要求已迫在眉睫。

為解決以上問題，淮陰師范學院、中國人民解放軍總醫院海南醫院和清華大學聯合研發了基于功能性DNA調節和過渡態CRISPR系統的超敏微流控生物傳感器（FTMB），實現了6種真菌毒素的同時定量檢測。在該系統中，觸發開關的高響應性不受傳感界面的空間限制，信號轉導機制使其能夠在復雜的生物背景下靈敏而特異地檢測小分子目標，能使真菌毒素和熒光信號之間建立直接的線性正相關。此外，該研究還進一步開發了具有高響應特性的過渡態CRISPR系統并評價了微流控芯片中流道對流體的操縱以及PC基底對量子點探針熒光的增強作用。所構建的FTMB系統具有小型化、批量生產和可調性等優點，在實際樣品分析中表現良好，具有高通量、準確性和重現性，為多種真菌毒素的快速檢測提供了良好的平臺。相關工作以“Microfluidic Biosensor Integrated with Signal Transduction and EnhancementMechanism for Ultrasensitive Noncompetitive Assay of Multiple Mycotoxins”為題發表在Analytical chemistry期刊上。

圖1 FTMB系統的檢測原理圖 ?

CRISPR/Cas12a雙重轉導機制的可行性

為了進一步確證功能DNA在真菌毒素檢測中的轉導機制的實用性，研究人員將功能DNA調控的CRISPR系統激活機制分別采用單鏈DNA（ssDNA，19nt）和FAM標記的Cas12a通用型DNA探針（FAM-TTATT-BHQ1）。如圖2A所示，在沒有相應激活子的反應體系中，ssDNA保持完整（通道1-2）。在使用功能性DNA鎖定激活子（通道3-8）時，成功限制了CRISPR系統的裂解功能。在此基礎上，在相應的真菌毒素（100 ng/mL）存在的情況下，6種真菌毒素的激活子可以觸發相應的CRISPR系統的反式切割活性，使ssDNA被切割成隨機短片段（通道9-14）。這種降解現象表明，6種適配子-1/激活子/適配子-2作為觸發開關可以成功啟動后續的級聯反應。

為了驗證聚丙烯酰胺凝膠電泳結果，基于功能DNA的觸發開關在常規CRISPR/12a熒光檢測系統中被進一步測試。實時熒光曲線顯示，在激活子不存在或鎖定時，熒光信號幾乎不積累，而在激活子存在或解鎖時，熒光值迅速增加（圖2B）。根據熒光測試結果（圖2C），功能DNA與激活子的最佳配比均為2:1。聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光定量分析結果表明，功能DNA具有識別目標分子的能力，同時激活子被成功鎖定。

為了進一步提高傳感器的檢測靈敏度和抗干擾能力，選用QDs作為一種全新的CRISPR系統探針的供體材料。與常規CRISPR探針相比，QDs的窄帶發射光譜和高的量子產率有利于高度匹配光子晶體的光子帶隙。此外，得益于QDs的寬吸收光譜，信號輸出可以在簡單的紫外燈照射下實現。考慮到綠色熒光波段是最常見的檢測輸出信號，因此選擇發射波長為520 nm的QDs。為了構建適合CRISPR系統的FRET模型，將含有淬滅基團BHQ1的DNA報告子修飾在量子點的表面，實現熒光猝滅。DNA報告子的濃度被進一步優化以達到最佳的猝滅效率。如圖2D，猝滅效率隨報告子濃度的增加而增加，直至在6 nmol（~100%）時達到完全猝滅。

圖2 CRISPR/Cas12a雙重轉導機制的可行性 ?

用于真菌毒素檢測的過渡態CRISPR系統的建立

同時具有不同形式Cas12a酶（封閉、中間和開啟）處于動態平衡狀態的CRISPR系統很容易用少量的激活子改變這種平衡，這有利于激活更多的Cas12a酶，從而使整體反式裂解活性大幅度提高。因此，推測CRISPR系統最敏感的狀態是亞穩態，即使是少量的激活子也可以很容易地激活Cas12a酶，誘導較強的裂解活性。由圖3A（2）可以看出，在激活子濃度相同的情況下，不同crRNA對應的CRISPR體系的反式切割活性不同。這是因為單個CRISPR系統的裂解活性是由多組分的性質共同驅動的，組分的結構和比例會對整個CRISPR系統的特性產生不同的影響。根據所選擇的能夠刺激Cas12a酶高活性的crRNA和激活子序列，調整組成比例有助于實現對低濃度目標真菌毒素的高響應。

為了確定分子開關的過渡狀態，研究人員首先評估了激活復合物（crRNA/激活子）對Cas12a酶的影響。對于固定濃度的Cas12a酶，激活復合物濃度增加至4 nM以上（保持crRNA：激活子的比例為1:1），Cas12a酶的附屬切割活性顯著提升（圖3B）。通過繪制激活曲線的一階導數，研究人員將分子開關分為三組，即開啟、過渡和關閉（圖3B插圖）。用高濃度的激活復合物（>8 nM）制作開啟態CRISPR系統。在響應范圍內，用中等濃度的激活復合物制備過渡態CRISPR系統，并對激活復合物濃度的變化保持響應（即，在Cas12a酶反應速率最高的頂點，用5.32 nM的激活復合物制作高響應CRISPR系統）。用低濃度的激活復合物（<3 nM）制成了封閉狀態的CRISPR系統。當研究人員通過減少激活子的數量（即降低增強子：crRNA的比例）來擾亂系統時，處于響應狀態的CRISPR系統顯示出Cas12a酶附屬切割活性的巨大變化（圖3C）。

為了建立過渡態，研究人員進一步調整激活子的數量（即由功能性DNA鎖定，通過觸發開關與目標結合被釋放），同時保持crRNA的數量不變（圖3D）。通過此優化，研究人員將過渡狀態定義為一階導數抑制圖（圖3D，插圖）上的頂點。這種被識別的過渡狀態表明其反應性進一步提高，Cas12a酶附屬切割速率最大，而開啟和封閉狀態CRISPR系統不能產生任何可識別的信號（圖3E）。比例調節的Cas12a酶不僅在與互補的目標毒素分子孵育時表現出顯著的附屬切割活性，而且在與非目標分子孵育時也保持低背景活性。針對六種真菌毒素設計的過渡態CRISPR系統都實現了更快的激活動力學。與在其它狀態下準備的開關相比，過渡態CRISPR系統能夠快速激活Cas12a酶。在室溫孵育40 min內，可以識別低濃度靶標。

圖3 用于真菌毒素檢測的過渡態CRISPR系統的建立

壓力驅動微流控芯片的液體流動測試

微流控芯片上的流體控制是真菌毒素高通量檢測的重要保證。為確定反應液在各室的均勻分布，采用添加紅色染料的反應液（上方25 μL礦物油）進行流體測試。流道設計受到自然分形樹系統的啟發，確保入口施加的壓力均勻分布在腔室上，以引導液體流動的劃分。這種分區方式的均勻性不受注入過程中壓力變化的影響，保證了100%的分區效率，利于用戶的友好使用。從圖4中可以看出，紅色液體均勻分布在左右八個檢測室中，并被后續的礦物油隔離，避免交叉污染。芯片底部設計的排氣通道利用毛細管效應形成一個截止閥，使腔內的空氣排出，但液體不能流出。為了保證結果的準確性，本研究分別采用右側的2個腔室作為陰性對照和陽性對照，另外6個腔室用于不同真菌毒素的檢測。此外，基于不同分形維數和分支級別的芯片設計，該策略可以進一步擴展為更高通量的檢測方案。

圖4 壓力驅動微流控芯片的組成和整個操作流程

FTMB系統的分析性能

在最佳實驗條件下，FTMB檢測系統中各真菌毒素標準曲線被構建。如圖 5A所示，FTMB系統傳感位點的亮度隨著真菌毒素濃度的增加而增加，這并不遵循競爭免疫分析法的原理。FTMB系統的信號轉導機制不需要與目標類似物競爭，通過減少信號標記修飾的識別分子的數量來實現量化。因此，FTMB系統中各位點的熒光強度與目標真菌毒素濃度呈正相關，這有利于檢測靈敏度的提高。由Michaelis-Menten方程得到的AFB?、OTA、ZEN、FB?、T-2、DON的標準回歸曲線（圖5A）。R2值范圍為 0.949 ~0.989，表明在檢測范圍內具有良好的相關系數。從標準曲線計算AFB?、OTA、ZEN、FB?、T-2和DON的檢測限（LOD）分別為 2.3 fg/mL、3.9 fg/mL、2.6 fg/mL、1.4 fg/mL、1.7?fg/mL 和 1.5 fg/mL。

為了進一步評估FTMB系統對單一和多重檢測的特異性，FTMB系統對單個AFB?、OTA、ZEN、FB?、T-2、DON及其混合物的熒光響應被研究（圖5B）。通過對AFB?、OTA、ZEN、FB?、T-2、DON等6種真菌毒素的單獨檢測，各檢測單元對應的目標毒素可觸發單元內的CRISPR反應從而恢復QDs的熒光。檢測單元對非目標毒素無反應，信號值與空白對照相似。對于多重檢測，當對多種真菌毒素的不同組合（2-plex、3-plex、4-plex和5-plex）進行測試時，FTMB系統也提供了準確的結果。在需要制備半抗原的競爭性免疫測定中，某些真菌毒素（如AFB?）在紫外線下的自發熒光可能會干擾結果的判讀。而FTMB系統通過觸發級聯反應發出熒光，則不受其影響。這些結果表明，FTMB系統的非競爭性檢測方法能夠準確、特異地檢測出單重或者多重目標毒素。

圖5 FTMB分析性能

綜上所述，該項研究成功開發了一種基于功能性DNA調節和過渡態CRISPR系統的超敏微流控生物傳感器，可以實現食品中真菌毒素的高通量識別。該傳感器通過設計的觸發開關建立了Cas12a酶的程序化側枝裂解活性與霉菌毒素濃度之間的正相關關系。在信號轉導方面，高靈敏度的過渡態被認為是提高CRISPR/Cas12a系統識別能力的關鍵因素。調整Cas12a酶的開放狀態和關閉狀態的比值對FTMB的分析性能有積極的影響。在增強信號方面，通過設計發射波段與芯片內光子帶隙高度匹配的量子點探針實現了信號顯著增強至45.6倍。該方法不需要對人體和環境造成生物危害的真菌毒素-蛋白偶聯物，也不需要制備復雜、繁瑣的抗體。為了進一步提高用戶友好性，FTMB系統的微流體平臺可以與自動化液體處理系統或者手動進樣兼容。FTMB通過樣品擴展和系統自動化，在真菌毒素殘留物聯合檢測方面具有廣闊的應用前景，可為食品的安全性評價和質量控制提供新的技術支持。

審核編輯：劉清