說(shuō)起冷凍電鏡，小編想不管是研究生還是教授大咖，可能和科研有那么一丁點(diǎn)聯(lián)系的人對(duì)這個(gè)名字都不會(huì)陌生，因?yàn)樗鼘?shí)在太出名了！基于冷凍電鏡產(chǎn)出的科研成果很多都發(fā)表在Nature、Science、Cell等頂刊上（羨慕臉），堪稱NSC神器。冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展直接帶動(dòng)了生命科學(xué)領(lǐng)域，特別是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的飛速發(fā)展，今年更是不負(fù)眾望（欺負(fù)我大化學(xué)）一舉拿下了“炸藥”化學(xué)獎(jiǎng)！不過(guò)，這些都不重要，畢竟他是隔壁生物家的孩子，以路人甲的姿態(tài)（羨慕但是我不表現(xiàn)出來(lái)）看看就好，反正也用不上！沒(méi)想到一個(gè)晴朗的日子，還有些風(fēng)和日麗的，Stanford的崔大神（崔屹）硬生生把它拽進(jìn)了我大材料圈，而且一鳴驚人，搞了篇Science！（就問(wèn)你服不服）聽(tīng)到這個(gè)消息，小編不禁陷入了深深的沉思，都是做材料的，怎么差別就這么大呢？（隔壁桌小林：人家是大牛！年輕的大牛！你，呵呵～）然而，短暫的沉思之后，小編知恥而后勇，決定好好看看這個(gè)“亂入”我材料圈的隔壁生物家的孩子，萬(wàn)一大老板某天心血來(lái)潮也弄了一臺(tái)放實(shí)驗(yàn)室了（大老板：我就呵呵不說(shuō)話），那小編豈不是有大大的優(yōu)勢(shì)，機(jī)智如我！獨(dú)機(jī)智不如眾機(jī)智，所以下面，小編帶大家共同了解一下這把生物圈的屠龍寶刀——冷凍電鏡！

1． 什么是冷凍電鏡？

冷凍電鏡，全稱冷凍電子顯微鏡技術(shù)（Cryo－electron microscopy， Cryo－EM）（我大材料的小伙伴也快好好記住這個(gè)單詞，相信不就的將來(lái)就會(huì)成為檢索材料學(xué)文獻(xiàn)的熱門(mén)關(guān)鍵詞），是指將生物大分子快速冷凍后，在低溫環(huán)境下利用透射電子顯微鏡對(duì)樣品進(jìn)行成像，再經(jīng)圖像處理和重構(gòu)計(jì)算獲得樣品三維結(jié)構(gòu)的方法［1］。圖1就是中科院生物物理研究所的FEI Titan Krios 300kV冷凍電鏡，據(jù)說(shuō)單臺(tái)應(yīng)該在600萬(wàn)美元以上。經(jīng)過(guò)30多年的發(fā)展，冷凍電鏡甚至超越了X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）支撐起了高分辨率結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。

圖1 FEI Titan Kiros 300kV 冷凍電鏡實(shí)物圖

那么為什么需要冷凍電鏡技術(shù)？眾所周知，X射線晶體學(xué)是解析結(jié)構(gòu)的經(jīng)典方法，然而它需要獲得生物樣品單晶，生物大分子的晶體生長(zhǎng)卻十分困難；而與此同時(shí)，材料學(xué)研究中早已使用電鏡直接觀察到了原子像［2］（作為一名材料汪，TEM、SEM的重要性我想無(wú)需贅言），于是生物學(xué)家也想用電鏡給生物大分子拍一張高清照片，解析其結(jié)構(gòu)，以理解其生化反應(yīng)機(jī)制，然而事情沒(méi)有那么簡(jiǎn)單，電子顯微鏡在生物領(lǐng)域的應(yīng)用受到了嚴(yán)重限制：（1）生物樣品含有豐富的水，而透射電鏡的工作條件是高度真空的；（2）高能電子束會(huì)嚴(yán)重破壞生物樣品；（3）生物樣品主要是C、O、N、H等輕元素，對(duì)電子的反射和散射與背景相似，獲得圖像襯度很低；（4）蛋白質(zhì)分子會(huì)漂移，導(dǎo)致圖像模糊。經(jīng)過(guò)眾多科學(xué)家的長(zhǎng)期努力，不斷克服種種困難，冷凍電鏡技術(shù)終于發(fā)展了起來(lái)，實(shí)現(xiàn)了溶液里生物分子高分辨率的結(jié)構(gòu)解析，使得生物化學(xué)進(jìn)入了一個(gè)新時(shí)代，其中3位有開(kāi)創(chuàng)性貢獻(xiàn)的科學(xué)家因此榮膺2017年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。他們分別是：瑞士洛桑大學(xué)Jacques Dubochet教授、美國(guó)哥倫比亞大學(xué)Joachim Frank教授和英國(guó)劍橋大學(xué)Richard Henderson教授。冷凍電鏡技術(shù)給出的生物大分子高清照相的方案是［1］：樣品冷凍→低劑量電子冷凍成像→三維重構(gòu)。

圖2 獲得2017年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的3位科學(xué)家

（1）樣品冷凍

樣品冷凍其實(shí)是科學(xué)家們很早就想到的思路，但是冷凍之后樣品中水分子形成冰晶，不僅產(chǎn)生強(qiáng)烈電子衍射掩蓋樣品信號(hào)，還會(huì)改變樣品結(jié)構(gòu)。直到1974年，Kenneth A． Taylor和Robert M． Glaeser在－120℃觀察含水生物樣品時(shí)未發(fā)現(xiàn)冰晶形成，而且發(fā)現(xiàn)冷凍樣品能夠耐受更大劑量和更長(zhǎng)時(shí)間的電子輻照，才為樣品冷凍帶來(lái)轉(zhuǎn)機(jī)。而上面提到的Jacques Dubochet老爺子則更進(jìn)一步，發(fā)現(xiàn)了水的玻璃態(tài)，成功解決了冷凍電鏡制樣問(wèn)題，如圖3 （a）所示［1］。

圖3 冷凍電鏡樣品制備（a）和三維重構(gòu)（b）示意圖

（2）低劑量電子冷凍成像

材料汪都知道一般做TEM、SEM的時(shí)候，樣品導(dǎo)電性越好，電子劑量越高，成像質(zhì)量越好。然而，高劑量電子對(duì)生物大分子卻是毀滅性的，因此Richard Henderson教授提出在低溫下用盡量低的電子劑量成像。他與其合作者先后在1975年和1990年重構(gòu)出了粗糙的（7?）和高分辨率（3．5?）的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的模型，如圖4所示，證明了冷凍電鏡用于生物大分子高分辨率結(jié)構(gòu)解析的可行性。然而，這個(gè)歷時(shí)15年的進(jìn)步與早在1984年就獲得膜蛋白3．0 ?分辨率原子模型的Hartmut Michel等人（1988年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者）相比似乎仍顯遜色。盡管情況不容樂(lè)觀，但是Henderson教授仍不斷從理論上指導(dǎo)冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展并預(yù)言：隨著電鏡技術(shù)和制樣水平的發(fā)展，冷凍電鏡必將成為疑難樣品和非結(jié)晶生物大分子結(jié)構(gòu)解析的有力工具。

圖4 細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的3D結(jié)構(gòu)模型

（3）三維重構(gòu)

做過(guò)TEM的小伙伴都知道，透射電鏡得到的是二維投影圖像，要得到三維的結(jié)構(gòu)，就要通過(guò)一系列建模、變換，這個(gè)過(guò)程就是三維重構(gòu)。上面提到的第3位諾獎(jiǎng)得主Joachim Frank就是和他的合作者建立了非對(duì)稱顆粒從二維投影到三維結(jié)構(gòu)的方法（隨機(jī)圓錐傾斜法），奠定了冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)的基本原理，如圖3（b）所示［3， 4］。隨后，開(kāi)發(fā)了SPIDER程序用于冷凍電鏡結(jié)構(gòu)分析，得到了廣泛應(yīng)用。目前，冷凍電鏡領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的三維重構(gòu)軟件是上面劍橋大學(xué)Richard Henderson老爺子實(shí)驗(yàn)室的Sjors Scheres博士（據(jù)說(shuō)當(dāng)時(shí)Sjors Scheres博士沒(méi)有一篇NSC論文，但Richard Henderson教授仍獨(dú)具慧眼將其引進(jìn)到劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室）開(kāi)發(fā)的RELLION。

然而，即便打通了任督二脈（上述3個(gè)關(guān)鍵流程），冷凍電鏡并沒(méi)有立即獲得今天這樣的爆紅。這主要是因?yàn)椋?）冷凍電鏡的信噪比低，（2）圖像攝取時(shí)漂移，使得可以獲取的二維投影仍是模糊狀態(tài)，因此僅能應(yīng)用于有限的生物大分子單顆粒的結(jié)構(gòu)解析，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。直到2013年，加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）的程亦凡教授等將直接電子探測(cè)器（DDD）用于記錄冷凍電鏡的單顆粒圖像，大大提高了信噪比與分辨率，實(shí)現(xiàn)了近原子分辨率（3．3 ?）的膜蛋白結(jié)構(gòu)的解析，才引起了業(yè)界的轟動(dòng)，如圖5所示。隨后，冷凍電鏡技術(shù)在生物大分子3D結(jié)構(gòu)解析中無(wú)往不利，堪稱屠龍寶刀。目前，美國(guó)NIH的Subramaniam實(shí)驗(yàn)室成功解析了谷氨酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá)到了1．8 ?，創(chuàng)造了最高分辨率的世界紀(jì)錄。

圖5 直接電子探測(cè)器應(yīng)用前后的分辨率對(duì)比

可見(jiàn)，正是3位諾獎(jiǎng)科學(xué)家在各自領(lǐng)域內(nèi)完成突破性的工作：Jacques Dubochet突破了冷凍技術(shù)的瓶頸，Joachim Frank在三維重構(gòu)算法上做出了原創(chuàng)性貢獻(xiàn)，Richard Henderson首次使用低電子劑量成像完成了生物大分子3D結(jié)構(gòu)的解析并一直在理論上指導(dǎo)冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，最終形成了0到1的飛躍，鑄造了冷凍電鏡這一把屠龍寶刀，開(kāi)創(chuàng)了結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的新局面。上述3位科學(xué)家獲得諾貝爾獎(jiǎng)?wù)驴梢哉f(shuō)當(dāng)之無(wú)愧！

2．冷凍電鏡在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的戰(zhàn)績(jī)

從NSC等頂刊的發(fā)文情況及源源不斷的生物大分子結(jié)構(gòu)被解析出來(lái)，冷凍電鏡在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域取得的巨大成功無(wú)需贅述。單單以中國(guó)大陸為例，基于冷凍電鏡技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域取得的重大進(jìn)展就十分可觀，具體如表1所示［5］（2016年）。而隨著冷凍電鏡技術(shù)的大熱，國(guó)內(nèi)的許多高校、科研院所紛紛花重金購(gòu)進(jìn)冷凍電鏡設(shè)備，已經(jīng)有超過(guò)24家獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室在采用冷凍電鏡進(jìn)行蛋白質(zhì)等生物大分子的3D結(jié)構(gòu)解析研究，如圖6所示［5］。

表1 2016年中國(guó)大陸基于冷凍電鏡取得的標(biāo)志性成果

圖6 國(guó)內(nèi)主要的冷凍電鏡分布圖

3．冷凍電鏡在材料科學(xué)中嶄露頭角

小編沒(méi)有查到在崔屹教授之前將冷凍電鏡技術(shù)應(yīng)用到材料科學(xué)領(lǐng)域的報(bào)道，但是不管有沒(méi)有，以Stanford的崔屹教授2017年10月27日在線發(fā)表在Science這篇題為“Atomic structure of sensitive battery materials and interfaces revealed by cryo－electron microscopy”的研究論文 ［6］作為冷凍電鏡在材料學(xué)研究中的一個(gè)開(kāi)端，小編認(rèn)為是合適的，畢竟它是“他山之石，可以攻玉”的一個(gè)典范，可以說(shuō)開(kāi)啟了材料科學(xué)研究的一個(gè)新世界。

做鋰電的小伙伴都知道，鋰枝晶是鋰電中最大的安全隱患，Samsung、Apple產(chǎn)品時(shí)不時(shí)出現(xiàn)的自燃事故和它不無(wú)關(guān)系。時(shí)至今日，枝晶的產(chǎn)生、生長(zhǎng)以及刺穿隔膜造成電池內(nèi)部短路，都是電池專家們不得不直面的問(wèn)題，也是材料領(lǐng)域“持續(xù)高溫”的研究方向。然而，眾所周知，鋰元素非常活潑，對(duì)環(huán)境極其敏感，如何從原子層面去研究鋰枝晶的形成和生長(zhǎng)，極具挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的高分辨TEM電子束能量很高，會(huì)嚴(yán)重?fù)p壞枝晶結(jié)構(gòu)甚至熔毀；而低分辨的TEM、直接成像、表面探針等技術(shù)獲得的信息又十分有限。在這篇Science論文中，崔屹教授等受“冷凍電鏡可以獲得脆弱的生物大分子原子級(jí)別結(jié)構(gòu)”的啟發(fā)，創(chuàng)造性地將冷凍電鏡技術(shù)引入到了敏感性電池材料和界面精細(xì)結(jié)構(gòu)的研究中，克服了電池材料冷凍制樣的種種難題，首次獲得了鋰枝晶原子分辨率級(jí)別的結(jié)構(gòu)圖像。結(jié)果顯示，冷凍電鏡技術(shù)完整地保留了枝晶的原始形貌及相關(guān)結(jié)構(gòu)、化學(xué)信息，在持續(xù)10min的電子束轟擊下仍然保持完好。高分辨的Cryo－EM照片表明鋰枝晶是呈長(zhǎng)條狀的完美六面晶體，完全迥異于傳統(tǒng)電鏡觀察到的不規(guī)則形狀；而其生長(zhǎng)行為顯示其有明顯的＜111＞優(yōu)先取向，生長(zhǎng)過(guò)程中可能發(fā)生“拐彎”，但是并沒(méi)有形成晶體缺陷，不影響其完美晶體結(jié)構(gòu)。另外，研究結(jié)果還包含固態(tài)電解質(zhì)界面（SEI）的組成與結(jié)構(gòu)。崔屹教授表示，研究結(jié)果十分令人興奮，證明了Cryo－EM可以有效地對(duì)那些脆弱、不穩(wěn)定的電池材料進(jìn)行高分辨率表征，例如鋰硅、硫等，并且保持它們?cè)谡鎸?shí)電池中的原始狀態(tài)。

圖7 通過(guò)Cryo－EM保存和穩(wěn)定鋰金屬

小編在查閱文獻(xiàn)過(guò)程中，也發(fā)現(xiàn)了另一篇采用Cryo－EM研究鋰電池的論文“New Insights on the Structure of Electrochemically Deposited Lithium Metal and Its Solid Electrolyte Interphases via Cryogenic TEM”，由美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校（UCSD）的孟穎教授（Ying Shirley Meng）等人發(fā)表在Nano Lett．上，發(fā)表時(shí)間為2017年11月1日，在線發(fā)表僅比崔教授的Science大作晚4天。文章［9］同樣是采取了冷凍電鏡技術(shù)穩(wěn)定了電化學(xué)沉積的活潑的鋰金屬，同時(shí)減少電子束帶來(lái)的損傷，然后對(duì)其納米結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成以及固態(tài)電解質(zhì)界面進(jìn)行了研究。可以說(shuō)和崔屹教授異曲同工，證明了Cryo－EM是研究對(duì)電子束、熱敏感的電池材料強(qiáng)有力的工具，能夠從最基礎(chǔ)的層面獲得相關(guān)信息。

圖8 Cryo－EM用于電沉積Li金屬的研究

除了上述兩篇將Cryo－EM用于鋰電池中敏感電池材料及SEI研究的論文外，就小編有限的認(rèn)知，可能在有機(jī)／無(wú)機(jī)雜化鈣鈦礦材料、某些高分子材料、水凝膠、量子點(diǎn)等精細(xì)結(jié)構(gòu)、中間態(tài)的表征中，Cryo－EM將具有的優(yōu)勢(shì)也是不言而喻的。可以預(yù)見(jiàn)，不久的將來(lái)，這些對(duì)電子束、熱敏感的活潑材料的原子級(jí)別的表征可能會(huì)是Cryo－EM在材料領(lǐng)域應(yīng)用的潛力方向。

4． 總結(jié)

2017年10月4日，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)一公布就引起了朋友圈的瘋狂調(diào)侃，認(rèn)為：冷凍電鏡是授予物理學(xué)家的化學(xué)獎(jiǎng)以獎(jiǎng)勵(lì)他們對(duì)生物領(lǐng)域的杰出貢獻(xiàn)，讓眾多化學(xué)汪深以為然。現(xiàn)在，崔屹教授的Science論文和孟穎教授的Nano Lett．論文終于讓這個(gè)化學(xué)獎(jiǎng)多了一些化學(xué)的意思了。這種隔壁生物家的孩子“跨界”材料圈完成的令人興奮的工作已經(jīng)隱隱有撬動(dòng)材料學(xué)相關(guān)研究的苗頭了。小編相信，這項(xiàng)引領(lǐng)生物化學(xué)研究進(jìn)入新時(shí)代的技術(shù)，攪動(dòng)我大材料江湖也是指日可期！

審核編輯：符乾江