再生是組織修復(fù)的“必殺技”,但皮膚損傷通常會(huì)產(chǎn)生纖維化的、無功能的疤痕。疤痕是指皮膚損傷后的纖維化,通過用非功能性結(jié)締組織替代功能性組織來確保傷口能夠盡快愈合。由于疤痕沒有皮膚的毛發(fā)或腺體,因此也不具有正常的體溫調(diào)節(jié)或屏障功能。盡管纖維化帶來的醫(yī)療負(fù)擔(dān)巨大,但目前尚無有效的治療方法,部分原因是缺乏對再生和纖維化愈合的基本機(jī)制的了解。所以想要發(fā)展促再生療法,需要深刻理解從損傷到纖維化或再生的分子軌跡。
近日,美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究組在Cell Stem Cell(IF:24.633)上發(fā)表了一篇題為Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing的文章,該研究以單細(xì)胞多組學(xué)方式(單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+蛋白質(zhì)組)描繪了YAP抑制背景下瘢痕與傷口再生的分子軌跡。 研究發(fā)現(xiàn),使用YAP (Yes-associated protein) 抑制劑可以防止成纖維細(xì)胞纖維化,并產(chǎn)生ENF (En-1-negative fibroblasts) 介導(dǎo)的再生,這一過程包括真皮附件如毛囊 (HF) 和腺體的恢復(fù)、細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 的結(jié)構(gòu)與未發(fā)生損傷皮膚 (UW) 的結(jié)構(gòu)相同以及具有相似的彈性。
纖維化和再生創(chuàng)傷的多模態(tài)分析
研究分析了7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠創(chuàng)面和皮膚:UW皮膚、術(shù)后第2天(炎癥期)、術(shù)后第7天(成纖維細(xì)胞增殖期)、術(shù)后第10天、術(shù)后第14天(傷口重新上皮化、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì))、術(shù)后第21天和術(shù)后第30天(成纖維細(xì)胞重塑ECM)。采用夾板切除傷口模型,該模型能夠防止皮膚松弛小鼠典型的傷口快速收縮,從而可以對傷口恢復(fù)過程進(jìn)行監(jiān)控。傷后立即在創(chuàng)面注射YAP抑制劑或?qū)φ站彌_液,對傷口進(jìn)行長時(shí)程多模分析。 對照組創(chuàng)面形成明顯的纖維瘢痕,有密集、線性排列的ECM纖維,無毛囊和腺體;而YAP抑制劑處理后的創(chuàng)面,有毛囊和腺體再生,ECM纖維密度較低,且生長方向更隨機(jī)。通過YAP敲除對該結(jié)果進(jìn)行再次確認(rèn),抑制劑與對照組之間處理的差異并非由于抑制劑的脫靶效應(yīng)引起。 根據(jù)FACS策略進(jìn)行細(xì)胞分類,分離成纖維細(xì)胞(Lin-) 和其他細(xì)胞 (主要是免疫細(xì)胞;Lin+)。對一半的細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq分析,總計(jì)2986個(gè)細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞在YAP抑制劑處理的創(chuàng)面中輕微增加;然而,對照組和YAP抑制劑創(chuàng)面的細(xì)胞比例大體相似,這表明YAP、抑制劑可能通過改變細(xì)胞表型而不是相對表征(或通過改變細(xì)胞類型中的亞群表征)來誘導(dǎo)再生。剩余的細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析(timsTOF質(zhì)譜分析)。主成分分析發(fā)現(xiàn)Lin-和Lin+蛋白組學(xué)標(biāo)本在不同時(shí)間點(diǎn)上差異很大,而PBS樣本和YAP抑制劑樣本的差異則比較狹窄,這表明蛋白質(zhì)組學(xué)分析可以在更廣泛的修復(fù)動(dòng)力學(xué)中捕獲連貫的纖維化變化。
疤痕形成與再生創(chuàng)面修復(fù)的多模態(tài)分析
(B)創(chuàng)傷愈合隨時(shí)間變化的小鼠配對多模態(tài)分析實(shí)驗(yàn)策略。
(C)按細(xì)胞類型(左上)、處理組(右上)、小鼠個(gè)體(左下)和POD(右下)著色的scRNA-seq細(xì)胞的多重投影。
(D)PBS和維替泊芬(YAP抑制劑)處理的傷口按時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞類型比例。
(E)Lin-(成纖維細(xì)胞,上)和Lin+(非成纖維細(xì)胞,下)細(xì)胞。
(F)頂部,量化294個(gè)ECM參數(shù)的圖像處理和分析管道示意圖輪廓。底部為對照(左)和椎體芬(右)傷口隨時(shí)間的t-SNE圖。綠色陰影區(qū)域,UW皮膚簇;疊加箭頭,ECM隨時(shí)間演化。
識(shí)別修復(fù)的分子軌跡
因?yàn)槌衫w維細(xì)胞是瘢痕形成的主要驅(qū)動(dòng)因素,研究假設(shè)YAP抑制劑通過改變成纖維細(xì)胞表型促進(jìn)再生,并將scRNA-seq分析集中在成纖維細(xì)胞上。單細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)再生過程和纖維化過程并不是相互排斥的,具有促再生活性的細(xì)胞可能存在于瘢痕創(chuàng)面之中,但是在沒有干預(yù)的情況下(例如YAP抑制劑處理),促纖維化分子的反應(yīng)會(huì)覆蓋再生的活性,并導(dǎo)致纖維化瘢痕表型。 此外,還分析了另外兩種與傷口相關(guān)的細(xì)胞亞群:骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。髓系細(xì)胞假時(shí)間分析顯示,炎癥基因(如Ccl6、Ccl9和Cxcl2)在早期富集,抗原呈遞基因(如H2復(fù)合物)在后期富集。然而,這些基因在PBS和YAP抑制劑細(xì)胞中表達(dá)相似,表明該分析沒有區(qū)分纖維化和再生愈合。淋巴樣細(xì)胞假時(shí)間分析也沒有區(qū)分纖維化和再生的傷口,而是分別反映了早期和晚期的NK和B/T細(xì)胞浸潤。發(fā)現(xiàn)抑制劑處理與對照組相比,免疫細(xì)胞的組成并沒有出現(xiàn)太大的差異。因此,疤痕表型是否產(chǎn)生并非是由于免疫細(xì)胞的差異,其原因可能還是主要集中在成纖維細(xì)胞之中。 使用CellChat分析scRNA-seq數(shù)據(jù)。CellChat強(qiáng)調(diào)了再生臂中涉及疤痕 (PBS) 成纖維細(xì)胞和非典型Wnt信號(hào)的促炎信號(hào)(如CXCL和IL6)的增加。這些獨(dú)特的功能富集項(xiàng),以及該組中較低的Dpp4表達(dá),暗示了由非瘢痕性ENF設(shè)計(jì)的獨(dú)特的分子愈合軌跡。
成纖維細(xì)胞相互作用的CellChat分析
(A)細(xì)胞群對間配體-受體相互作用的強(qiáng)度。邊緣寬度與配體-受體對的數(shù)量成正比。
(B)如(A)中,按細(xì)胞種群劃分的子集。
(C)熱圖顯示了基于指定信號(hào)網(wǎng)絡(luò)(ncWNT, noncanonical Wnt)的計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中心性度量的每個(gè)細(xì)胞群的相對重要性。
(D和E)推斷出的分泌細(xì)胞輸出(D)和輸入(E)通信模式,顯示出推斷出的潛伏模式和細(xì)胞群之間的對應(yīng)關(guān)系(左)和信號(hào)通路(右)。
傷口纖維化和再生軌跡標(biāo)記物的研究
基于綜合多模態(tài)分析,試圖驗(yàn)證不同創(chuàng)傷表型中關(guān)鍵基因的相關(guān)性。圖譜中差異表達(dá)的基因指向了Wnt信號(hào)通路,包括Wnt的靶標(biāo)基因、拮抗基因以及一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子Trps1。先前的研究表明Trps1是Wnt信號(hào)通路的主要調(diào)節(jié)因子,且與皮膚腺體的發(fā)育、生長和增殖相關(guān)。通過Trps1基因敲除以及過表達(dá)實(shí)驗(yàn),研究確認(rèn)該基因?qū)τ趥谠偕潜匾页浞值摹VС至薊NF介導(dǎo)的愈合(低Dpp4)在YAP抑制(低Ankrd1)的傷口中通過Wnt激活(高Trps1和Rspo1)實(shí)現(xiàn)HF再生這一發(fā)現(xiàn)。
確定Trps1在再生中的功能意義
鑒于Trps1在Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、HF形態(tài)發(fā)生和YAP調(diào)控中的重要性,以及Trps1+成纖維細(xì)胞和HF再生的空間關(guān)系,研究試圖確定Trps1在創(chuàng)面再生中的作用。綜合多模態(tài)分析區(qū)分了兩種修復(fù)軌跡。第一種是EPF介導(dǎo)的 (Dpp4+),以機(jī)械激活(高核YAP,Ankrd1+,Trps1-)為特征,導(dǎo)致疤痕ECM。二是ENF介導(dǎo) (Dpp4-),缺乏機(jī)械活化(低核YAP,Ankrd1-,Trps1+),并通過Wnt激活導(dǎo)致正常ECM和HF的再生。 總結(jié)一下,該研究通過對傷口再生進(jìn)行YAP抑制劑處理后的長時(shí)程多模分析,建立了傷口再生的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及蛋白質(zhì)圖譜,對研究皮膚傷口再生與纖維化瘢痕形成的阻斷具有重要價(jià)值。 審核編輯:郭婷
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原文標(biāo)題:學(xué)術(shù)動(dòng)態(tài) | 單細(xì)胞+timsTOF揭示傷口再生的動(dòng)態(tài)圖譜
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