克服光學(xué)衍射極限,觀察到亞細(xì)胞尺度的生物結(jié)構(gòu)和變化過程一直是生命科學(xué)研究的目標(biāo)之一,也是超分辨顯微鏡誕生的目的所在。隨著現(xiàn)代顯微成像技術(shù)的發(fā)展和不斷突破,超分辨顯微成像大家庭也一直在補(bǔ)充新鮮血液。不過,這些形形色色的技術(shù)各自也都存在著不足:譬如前面幾期中我們提到的 PALM/ STORM/DNA-PAINT 等單分子定位技術(shù)都需要長時間的多幀采集,并需要高功率激發(fā)光。這意味著它們在很大程度上不適合對活細(xì)胞進(jìn)行成像。
在超分辨顯微成像專題的最后一期中,我們將為大家介紹一種完全不同的,適合活細(xì)胞的超分辨顯微技術(shù)——結(jié)構(gòu)光照明顯微成像(Structure Illumination Microscopy, SIM)。
SIM 的原理
SIM 最早是在2005年由 Mats Gustafsson 開發(fā)并提出的,其基本原理是基于莫爾條紋(Moire pattern)——一種常用于產(chǎn)生光學(xué)錯覺的效應(yīng)。
莫爾條紋:由兩個空間頻率相近的周期性光柵圖形疊加而形成的光學(xué)條紋。當(dāng)兩條線或兩個物體之間以恒定的角度和頻率發(fā)生干涉,而人眼無法分辨這兩條線或兩個物體時,只能看到干涉的花紋。
這個概念聽起來有點(diǎn)高深,但其實(shí)莫爾條紋是一種我們在生活中隨處可見的現(xiàn)象(圖1)。大家可以翻翻看自己穿著條紋襯衫的照片,說不定就能看到莫爾條紋的身影哦。
圖1 生活中的莫爾條紋
從圖2我們可以更加直觀地了解莫爾條紋是如何用于顯示高頻信息的:當(dāng)兩個小尺寸(高頻)網(wǎng)格疊加覆蓋在最右邊的圖像中時,它們之間發(fā)生干涉后就會顯示一個較大尺寸(低頻)的網(wǎng)格,這個網(wǎng)格會包含兩個較小網(wǎng)格的信息。
圖2 兩個相互成一定角度重疊的細(xì)網(wǎng)格相互干涉形成的莫爾條紋。From Wikimedia commons
在實(shí)際使用時,通過在照明光路中插入一個結(jié)構(gòu)光的發(fā)生裝置(如光柵,空間光調(diào)制器,或者數(shù)字微鏡陣列DMD等),照明光受到調(diào)制后,形成亮度規(guī)律性變化的圖案,然后經(jīng)物鏡投影在樣品上,調(diào)制光所產(chǎn)生的熒光信號再被相機(jī)接收。通過移動和旋轉(zhuǎn)照明圖案使其覆蓋樣本的各個區(qū)域,并將拍攝的多幅圖像用軟件進(jìn)行組合和重建,就可以得到該樣品的超分辨率圖像了。由于需要組合多個圖像,SIM 的成像過程是需要一定時間的,不過遠(yuǎn)比STORM這樣的單分子定位超分辨顯微技術(shù)要快許多。
還有一種速度更快的SIM技術(shù)——iSIM(Instant SIM)。它的前身是多焦點(diǎn)SIM(multifocal SIM,mSIM)。mSIM結(jié)合了共聚焦和結(jié)構(gòu)光照明——不是用線,而是用多個稀疏的光點(diǎn)排列成圖案進(jìn)行照明(圖2)。這些焦點(diǎn)由微透鏡形成,并與發(fā)射光路徑上的針孔相結(jié)合,達(dá)到光學(xué)切片的效果。微透鏡陣列可以對來自每個照明焦點(diǎn)圖像進(jìn)行2倍的光學(xué)收縮,然后通過振鏡將帶有圖案的激發(fā)光投射到整個樣品上進(jìn)行成像。Curd 等人在文章詳細(xì)說明了構(gòu)建iSIM系統(tǒng)的過程(Curd et al., 2015.)。
iSIM 不同于 mSIM 的地方在于,它可以通過微透鏡陣列和掃描振鏡直接組合多個位置的圖像,不需要通過軟件,從而大大提高了速度,并減少了相機(jī)噪聲的影響。與PALM/STORM 等技術(shù)相比,iSIM 的速度能提高100倍。與其它結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)相比,iSIM 對樣品的穿透能力要高上10倍,并且具有比轉(zhuǎn)盤共聚焦更好的光學(xué)切片能力,這樣一來,后期反卷積處理的效果也非常好。
圖3 產(chǎn)生多焦點(diǎn)激發(fā)的會聚微透鏡陣列。激發(fā)樣品后,用與微透鏡陣列匹配的針孔陣列抑制非焦平面的雜散光。借助于第二個微透鏡陣列,每個針孔發(fā)射的熒光可實(shí)現(xiàn)2倍收縮。振鏡用于光柵多焦激發(fā)和和收集多焦發(fā)射光,在每次曝光期間產(chǎn)生超分辨率圖像(為清晰起見,本圖僅顯示部分振鏡)。(York et al., 2013)
左:原始圖像。右:左圖的動畫示意。
SIM 的應(yīng)用
SIM 和 iSIM 可以將傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率極限降低一半,更重要的是能夠?qū)罴?xì)胞進(jìn)行超分辨成像。iSIM 能夠以高達(dá) 100Hz 的頻率采集圖像,并且具有更好的光學(xué)切片能力。這使得 iSIM 能夠在使用傳統(tǒng)熒光染料的同時,對生物結(jié)構(gòu)內(nèi)部進(jìn)行3維時間序列的超分辨成像。從而讓研究人員可以突破光學(xué)分辨率極限,觀察細(xì)胞和組織內(nèi)微觀結(jié)構(gòu)的動態(tài)過程。
圖4將 iSIM 與其他活細(xì)胞成像技術(shù)(轉(zhuǎn)盤共聚焦,線掃描共聚焦)的分辨率進(jìn)行了比較。這個樣品的挑戰(zhàn)是線粒體內(nèi)部空隙中沒有 Mcherry 表達(dá),因此只有用 iSIM 才能實(shí)現(xiàn)超分辨(圖c中用白色箭頭所示)。
圖4 表達(dá) TFAM-GFP(綠色)和 Tom20-mCherry(紫色)的MRL-TR轉(zhuǎn)化人肺成纖維活體細(xì)胞。圖a-c用iSIM拍攝,d-f用轉(zhuǎn)盤共聚焦拍攝,g-i用線掃描共聚焦顯微鏡拍攝。(York et al., 2013)
圖a, d, g所示為3 μm體素的最大強(qiáng)度投影(XY),高倍圖顯示的為白色箭頭指示區(qū)域在對應(yīng)時間點(diǎn)的圖像。
圖b, e, h: a, d, g高倍圖中白色矩形區(qū)域的高倍放大。Scalebars: 0.5μm
圖c, f, i: a, d, g中黃線指示的~270 nm切片的軸向(ZY)視圖。Scalebars: 1μm
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運(yùn)動和生長非常迅速,新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管的形成和生長發(fā)生在約100ms的時間尺度上,iSIM 能夠非常清楚地捕捉到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生長過程(圖5)。
圖5 iSIM拍攝的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)動力學(xué)圖像(100Hz)(Yorket al., 2013)
A:200個時間序列中的第一張圖像,顯示了在MRL-TR轉(zhuǎn)化人肺成纖維細(xì)胞內(nèi)GFP-Sec61A標(biāo)記的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Scalebar:10 μm
B:A中白色大矩形區(qū)域的放大圖像。白色箭頭指示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管的生長,藍(lán)色指示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管的重塑。Scalebar:5 μm
C:A中白色小矩形的放大圖像,140ms內(nèi)新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管形成過程。Scalebar:200 nm
使用iSIM,York等人還成功地對3日齡斑馬魚紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了活體成像(圖6),避免了由于運(yùn)動導(dǎo)致的圖像模糊。展示出了對活樣品生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行無創(chuàng)成像的能力。
圖6 上:100個2D圖像(2673ms)的最大強(qiáng)度投影。顯示3日齡斑馬魚胚胎腦部血細(xì)胞中GFP標(biāo)記的微管。成像深度:20μm;運(yùn)動方向:從左到右,清晰的細(xì)胞邊界顯示沒有由于運(yùn)動導(dǎo)致的圖像模糊。Scalebar:10μm
下:上圖中紅色方框在特定時間的圖像。黃色箭頭:同一細(xì)胞末端的“尾巴”結(jié)構(gòu);黃色小箭頭:尾部的微管;紅色箭頭:細(xì)胞內(nèi)的微管。Scalebar:2μm。
適合 SIM 的科學(xué)相機(jī)
SIM 常用于進(jìn)行高時間分辨率的活體超分辨成像,高速的 sCMOS相機(jī)是它們的最佳搭檔。另一方面,由于曝光時間短,SIM對相機(jī)采集信號的能力要求也比較高。
因此,背照式sCMOS相機(jī)是一個不錯的選擇,如Prime BSI,Prime BSI express,Prime 95B等。95%量子效率帶來的高靈敏度,再加上低讀出噪聲,可以在提高采集速度的同時保證圖片信噪比。另外,均勻的背景對SIM和iSIM這種靠結(jié)構(gòu)光照明來實(shí)現(xiàn)超分辨成像的技術(shù)來說也很重要。
審核編輯 :李倩
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光學(xué)顯微技術(shù)
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原文標(biāo)題:結(jié)構(gòu)光照明顯微成像(SIM)
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