miRNA是一類小分子量的非編碼RNA片段，通過與靶向mRNA結(jié)合，發(fā)揮基因沉默和翻譯抑制的功能。miRNA通過調(diào)控生物體一系列的生長發(fā)育過程，可以幫助生物體應(yīng)對各種各樣的環(huán)境變化，維持正常的生命活動。因此，理解miRNA的發(fā)生調(diào)控過程，尤其是miRNA在不同組織、不同生長發(fā)育時期、不同生理狀態(tài)時的含量，顯得尤為重要。

納米孔檢測技術(shù)作為20世紀90年代中期發(fā)展至今的一種分析手段，因為其無標記、高靈敏等優(yōu)勢，已經(jīng)逐漸成為化學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)一種重要的單分子級別的分析檢測方法。而基于納米孔的核酸分析是納米孔檢測領(lǐng)域中最成功的方向，尤其是基于納米孔測序方法開發(fā)的第三代測序技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域的研究中。因此，納米孔檢測技術(shù)有望在miRNA的分析檢測中做出獨特的貢獻。

近期，來自東京農(nóng)工大學(xué)的Ryuji Kawano教授在JACS Au上發(fā)表了題為“Pattern Recognition of microRNA Expression in Body Fluids Using Nanopore Decoding at Subfemtomolar Concentrations”的文章，提出了一種使用發(fā)夾DNA探針的miRNA檢測方法，理論上實現(xiàn)了膽管癌樣本中阿摩爾水平（10?1?M）的miRNA檢測。

研究人員使用的實驗裝置如圖1a、b所示，選擇miR-193、miR-106a、miR-15a、miR-374和miR-224作為靶標miRNA，因為這些miRNA已經(jīng)被報道在人的膽管癌細胞中過表達。接下來，研究人員設(shè)計了一條可以與這五種miRNA互補配對的5’端含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈DNA-HP-dgDNA（圖1c），HP-dgDNA和miRNA配對后的熱力學(xué)模擬結(jié)構(gòu)如圖1d所示。當與miRNA雜交的HP-dgDNA通過αHL納米孔時，互補配對的雙鏈區(qū)域在電壓驅(qū)動下發(fā)生解旋，且解旋時間隨著互補配對位置個數(shù)減少而減少（圖1e），因此，可以通過雜交鏈的解旋過孔時間來大致判斷有幾種miRNA與HP-dgDNA發(fā)生互補配對。

為了驗證該檢測方法的可行性，研究人員首先使用合成miRNA分別制備了膽管癌miRNA樣品（存在5種miRNA）和兩種健康的miRNA樣品（存在1或3種miRNA）。三種樣品分別與HP-dgDNA雜交，含1種（圖2a）、3種（圖2b）或5種（圖2c）miRNA樣品的過孔時間如圖所示。其統(tǒng)計結(jié)果如圖2d所示，可以看到含有3種或5種miRNA互補的雜交鏈解旋過孔時間明顯長于只含1種miRNA的過孔時間，五類只含1種miRNA的雜交鏈過孔時間也在統(tǒng)計上存在一點區(qū)分（圖2d，f），并且所有含miRNA的雜交鏈的過孔時間都大于HP-dgDNA單鏈的過孔時間（圖2e）。同時，根據(jù)模擬的結(jié)果，研究人員還發(fā)現(xiàn)雜交鏈過孔時間是隨著雜交鏈解旋所需能量增大而延長的（圖2g）。研究人員在圖2中驗證了可以利用雜交鏈解旋過孔的時間差異來區(qū)分與HP-dgDNA雜交的miRNA數(shù)量差異，從而匯報出樣品中miRNA大致的種類。

在驗證了方法的可行性后，研究人員測試了該方法針對臨床樣本的有效性。盡管miR-15a、miR-193、miR-224、miR-106a和miR-374這五種miRNA已經(jīng)被報道在膽管癌患者中過表達，研究人員仍然先使用RT-qPCR對從血漿樣品中提取的miRNA進行定量（圖3a，b），可以發(fā)現(xiàn)相較于健康人而言，癌癥患者中這五種miRNA的表達量都較高，其中miR-193，miR-106a和miR-15a的表達量顯著高于健康水平。隨后，研究人員使用納米孔傳感了從血漿中提取的miRNA與HP-dgDNA的雜交鏈（圖3c），可以看到癌癥患者中提取到的miRNA與HP-dgDNA形成雜交鏈的解旋過孔時間（1487ms）明顯長于健康人（856ms）提取到的miRNA雜交鏈的過孔時間（圖3e，f）。圖3說明了可以根據(jù)雜交鏈的過孔時間來區(qū)分癌癥患者與健康人的miRNA表達量差異。

最后，研究人員探究了該方法理論上的檢測限。分別使用0.1、1、10和100fM的miRNA與500nM HP-dgDNA雜交（圖4b，c），可以發(fā)現(xiàn)小于100fM的miRNA雜交鏈過孔時間隨著濃度提高而增加，且都大于僅存在HP-dgDNA單鏈的過孔時間（圖4f）。因此，研究人員認為只要miRNA雜交鏈的過孔時間稍大于HP-dgDNA單鏈的過孔時間都可以被認為實現(xiàn)了檢測，通過理論計算可以得到該方法的理論檢測限為0.3fM。

該論文一經(jīng)發(fā)表就受到領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，上線不到一個月時間Altmetric指標就達到了92，但是不可否認的是，相較于如此高的關(guān)注度，該方法仍然有很多問題亟待解決，如：1）過時間被判斷為可區(qū)分的差異程度沒有定義，很多擬合峰相互重合；2）血漿中提取miRNA是否會因為除了這五種miRNA以外的其他miRNA與單鏈DNA部分互補從而影響了過孔時間；3）癌癥患者的過孔時間統(tǒng)計分布與健康人基本相同，該方法對患者之間的差異對疾病診斷的影響。

作者：Nanami Takeuchi， Moe Hiratani， and Ryuji Kawano*