miRNA是一類小分子量的非編碼RNA片段，通過與靶向mRNA結合，發揮基因沉默和翻譯抑制的功能。miRNA通過調控生物體一系列的生長發育過程，可以幫助生物體應對各種各樣的環境變化，維持正常的生命活動。因此，理解miRNA的發生調控過程，尤其是miRNA在不同組織、不同生長發育時期、不同生理狀態時的含量，顯得尤為重要。

納米孔檢測技術作為20世紀90年代中期發展至今的一種分析手段，因為其無標記、高靈敏等優勢，已經逐漸成為化學、生物學領域內一種重要的單分子級別的分析檢測方法。而基于納米孔的核酸分析是納米孔檢測領域中最成功的方向，尤其是基于納米孔測序方法開發的第三代測序技術已經被廣泛地應用于生命科學領域的研究中。因此，納米孔檢測技術有望在miRNA的分析檢測中做出獨特的貢獻。

近期，來自東京農工大學的Ryuji Kawano教授在JACS Au上發表了題為“Pattern Recognition of microRNA Expression in Body Fluids Using Nanopore Decoding at Subfemtomolar Concentrations”的文章，提出了一種使用發夾DNA探針的miRNA檢測方法，理論上實現了膽管癌樣本中阿摩爾水平（10?1?M）的miRNA檢測。

研究人員使用的實驗裝置如圖1a、b所示，選擇miR-193、miR-106a、miR-15a、miR-374和miR-224作為靶標miRNA，因為這些miRNA已經被報道在人的膽管癌細胞中過表達。接下來，研究人員設計了一條可以與這五種miRNA互補配對的5’端含發夾結構的單鏈DNA-HP-dgDNA（圖1c），HP-dgDNA和miRNA配對后的熱力學模擬結構如圖1d所示。當與miRNA雜交的HP-dgDNA通過αHL納米孔時，互補配對的雙鏈區域在電壓驅動下發生解旋，且解旋時間隨著互補配對位置個數減少而減少（圖1e），因此，可以通過雜交鏈的解旋過孔時間來大致判斷有幾種miRNA與HP-dgDNA發生互補配對。

為了驗證該檢測方法的可行性，研究人員首先使用合成miRNA分別制備了膽管癌miRNA樣品（存在5種miRNA）和兩種健康的miRNA樣品（存在1或3種miRNA）。三種樣品分別與HP-dgDNA雜交，含1種（圖2a）、3種（圖2b）或5種（圖2c）miRNA樣品的過孔時間如圖所示。其統計結果如圖2d所示，可以看到含有3種或5種miRNA互補的雜交鏈解旋過孔時間明顯長于只含1種miRNA的過孔時間，五類只含1種miRNA的雜交鏈過孔時間也在統計上存在一點區分（圖2d，f），并且所有含miRNA的雜交鏈的過孔時間都大于HP-dgDNA單鏈的過孔時間（圖2e）。同時，根據模擬的結果，研究人員還發現雜交鏈過孔時間是隨著雜交鏈解旋所需能量增大而延長的（圖2g）。研究人員在圖2中驗證了可以利用雜交鏈解旋過孔的時間差異來區分與HP-dgDNA雜交的miRNA數量差異，從而匯報出樣品中miRNA大致的種類。

在驗證了方法的可行性后，研究人員測試了該方法針對臨床樣本的有效性。盡管miR-15a、miR-193、miR-224、miR-106a和miR-374這五種miRNA已經被報道在膽管癌患者中過表達，研究人員仍然先使用RT-qPCR對從血漿樣品中提取的miRNA進行定量（圖3a，b），可以發現相較于健康人而言，癌癥患者中這五種miRNA的表達量都較高，其中miR-193，miR-106a和miR-15a的表達量顯著高于健康水平。隨后，研究人員使用納米孔傳感了從血漿中提取的miRNA與HP-dgDNA的雜交鏈（圖3c），可以看到癌癥患者中提取到的miRNA與HP-dgDNA形成雜交鏈的解旋過孔時間（1487ms）明顯長于健康人（856ms）提取到的miRNA雜交鏈的過孔時間（圖3e，f）。圖3說明了可以根據雜交鏈的過孔時間來區分癌癥患者與健康人的miRNA表達量差異。

最后，研究人員探究了該方法理論上的檢測限。分別使用0.1、1、10和100fM的miRNA與500nM HP-dgDNA雜交（圖4b，c），可以發現小于100fM的miRNA雜交鏈過孔時間隨著濃度提高而增加，且都大于僅存在HP-dgDNA單鏈的過孔時間（圖4f）。因此，研究人員認為只要miRNA雜交鏈的過孔時間稍大于HP-dgDNA單鏈的過孔時間都可以被認為實現了檢測，通過理論計算可以得到該方法的理論檢測限為0.3fM。

該論文一經發表就受到領域的廣泛關注，上線不到一個月時間Altmetric指標就達到了92，但是不可否認的是，相較于如此高的關注度，該方法仍然有很多問題亟待解決，如：1）過時間被判斷為可區分的差異程度沒有定義，很多擬合峰相互重合；2）血漿中提取miRNA是否會因為除了這五種miRNA以外的其他miRNA與單鏈DNA部分互補從而影響了過孔時間；3）癌癥患者的過孔時間統計分布與健康人基本相同，該方法對患者之間的差異對疾病診斷的影響。

作者：Nanami Takeuchi， Moe Hiratani， and Ryuji Kawano*