腫瘤干細胞（CSCs）是癌癥復發、惡化和無效治療的主要原因之一。免疫檢查點療法是目前腫瘤治療中潛力較大的一種治療策略，如抗程序性死亡-1抗體（aPD-1）的免疫治療已經在多種腫瘤治療中發揮抑瘤的作用。但是，整體的治療效果往往受到CSCs免疫逃避的限制。抗CSCs的治療將有助于提升癌癥的整體治療效果，改善目前臨床中免疫檢查點療法的局限。

基于此，廣州醫科大學謝茂彬教授團隊研制了一種集協同免疫和氫治療于一體的可穿戴絲質微針裝置（SMND），由雙層MN貼片（DLMNP）組成，以載aPD-1的絲素蛋白（SF）為內基質，以載氨硼烷的介孔二氧化硅納米顆粒（AB-MSN）包覆聚己內酯為外熱響應涂層進行H?釋放。結果顯示該協同治療策略可實現令人滿意的抗腫瘤和抗CSCs療效，同時全身毒性最小。相關工作以“A Smart Silk-Based Microneedle for Cancer Stem Cell Synergistic Immunity/Hydrogen Therapy”為題于2022年7月18日發表在Advanced Functional Materials期刊。

圖1 SMND制備與智能給藥原理圖。a）無線連接SMND經皮給藥小鼠黑色素瘤模型示意圖。b）負載雙藥的DLMNP的結構。c）AB-MSN的制備方法示意圖及酸觸發分解和H?釋放機理。d）智能手機控制SMND的智能熱響應藥物釋放示意圖。e）SMND抗CSCs協同免疫/氫治療機制示意圖。

研究人員開發的SMND體積小巧、重量輕，由于其可彎曲性和手腕帶的靈活性，可以包裹在患者的手腕上。加熱膜與FPCB電連接，粘在DLMNP背面。FPCB尺寸為50mm × 25mm，重量較輕，只有24g。此外，SMND的加熱膜是微型的，直徑為10mm，厚度為0.5mm。采用微成型技術在PDMS母模上制備了該貼片的DLMNP。光學顯微鏡表征了DLMNP的結構和形態。每個金字塔MN都整齊地排列成15 × 15方陣，中心距離為1500μm。每個MN的平均高度為600μm，頂端直徑為20μm，底部直徑為200μm。羅丹明6G作為模型藥物，包裹在DLMNP中。結果表明，羅丹明6G可以在MN中均勻荷載。使用定制開發的智能手機APP進行SMND在實際應用場景下的調試。首先點擊APP圖標進入APP界面。整個界面分為搜索藍牙按鈕、加熱按鈕、停止加熱按鈕三個功能按鈕，以及藍牙信息顯示窗口和實時溫度顯示窗口兩個顯示窗口。然后，點擊SEARCH面板，找到目標藍牙BT16。最后，在藍牙信息顯示窗口點擊BT16，即可成功連接智能手機與FPCB的藍牙連接。同時，FPCB中的紅燈會亮起來，表示連接成功。然后點擊HEAT面板，觸發加熱膜的加熱功能。同時，可以實時顯示溫度，并伴有燈圖標的顏色變化。一旦溫度達到50攝氏度，它就會保持這個溫度。點擊STOP按鈕后，溫度會逐漸下降。因此，可以通過APP指令HEAT/STOP啟動熱膜熱驅動和熱控制。

圖2 SMND的電子和物理結構。a）腕帶下SMND與FPCB組裝的光學圖像。b）FPCB上詳細塊電路的光學圖像。c）與FPCB電連接的柔性加熱膜的光學圖像。d）DLMNP的數碼照片。e）羅丹明6G染色DLMNP及其平臺的數字顯微鏡圖像（f）和側視圖（g）。h）定制智能手機APP加熱控制和數據顯示的實時操作：（步驟1）點擊桌面圖標進入APP；（步驟2）點擊SEARCH面板查找目標藍牙名稱；（步驟3）選擇目標藍牙BT16進行連接；（步驟4）點擊所述HEAT面板，對所述柔性電路進行加熱控制；（步驟5）點擊停止面板，停止加熱。

DLMNP由SF基內層MN和PCL基外層組成。DLMNP的表面是白色的，而不是像內部SF MN那樣透明的。在噴涂前后，除表面外觀外，DLMNP的形狀和結構沒有變化。在DLMNP表面觀察到多孔和顆粒形態，同時內SF MN表面相對光滑。此外，還引入了FITC標記的PCL，并將Rhodamine 6G標記的SF引入DLMNP制造過程，通過這兩種染料之間的發射波長差異來幫助區分這兩種成分。顯然，在DLMNP的每一根針中都可以觀察到紅色和綠色的熒光，證明了整個DLMNP中兩種化合物的均勻整合。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像顯示了DLMNP的雙層結構。采用乙醇蒸氣后處理來調節SF的二級結構，以控制其溶出速率。通過FTIR和X射線衍射（XRD）揭示不同時間（0、2、4、6和8h）乙醇蒸汽處理SF MN內部的構象和二級結構變化。未經乙醇蒸汽處理的原始SF MN在1656/cm（酰胺I）、1537/cm（酰胺II）、1250/cm（酰胺III）處的紅外吸收峰相對較弱，在12.1處有一個典型的絲I晶體峰，具有典型的無規則線圈構像和主要的非晶結構特征，[26a,29]對應著快速溶解的特征。然而，經過乙醇蒸汽后處理的SF MN在1627/cm（酰胺I）、1525/cm（酰胺II）、1526/cm（酰胺II）和1230/cm（酰胺III）處出現了尖銳的吸收峰，以及顯著的典型絲狀II晶體峰，在XRD中為20.2°、28.0°和30.9°，這是β-薄片構像的代表。未處理的SF MN比后處理的SF MN在開始時的藥物釋放率明顯更高。在28h內，原始SF MN的累積藥物釋放量達94.1% ± 4.2%，而8h乙醇蒸汽后處理SF MN的累積釋藥量僅為55.2% ± 3.3%。不同的乙醇蒸汽處理時間對SF MN后處理的釋放速率有影響。隨著乙醇蒸汽處理時間的增加，SF MN后處理藥物釋放速率減慢。力學試驗中DLMNP的穿透力如圖所示，由于豬皮的固有阻力特性，力隨著載荷位移的增加而逐漸增大。隨著插入的進行，可以清楚地觀察到P點插入力的一個小的突然下降。這表明DLMNP壓縮超過了皮膚破裂極限，導致皮膚穿透。因此，DLMNP的穿透力為0.58N，遠小于破壞力1.78N。此外，對處理過的豬皮進行了觀察，發現具有類似大小的DLMNP的陣列排列的紅色斑點，表明DLMNP確實在皮膚上產生了微孔。DLMNP擁有aPD-1加載的內矩陣和AB-MSN封裝的PCL涂層。制備了熱響應的PCL涂層，用于控制H?的釋放。PCL的熱相變特性賦予了DLMNP的熱反應性能，可以通過探索封裝aPD-1的釋放來反映。DLMNP加熱15min（50℃），未涂覆MN組在228h內累積釋放aPD-1為49.0% ± 2.4%，略高于未加熱的DLMNP組（33.19% ± 1.2%）。相反，加熱組的aPD-1釋放量在初始15min內急劇增加，表明PCL在加熱到閾溫度后發生了由固態到液態的相變。考慮到MN加熱導致aPD-1失活的風險，研究人員測試了aPD-1從DLMNP中釋放后的生物活性。據估計，釋放的aPD-1在4℃下儲存16天后，90%以上的aPD-1仍然具有與PD-1抗原結合的生物活性。同樣，PCL在DLMNP中的熱相變特性可以通過H?的釋放反映。只有當溫度達到50℃（PCL的相變溫度）時才能生成H?，這進一步說明了DLMNP的熱響應能力。

圖3 DLMNP的理化特性。a）未涂PCL的DLMNP的數字顯微鏡圖像。b）未涂PCL的DLMNP的SEM圖像：b（i）單個MN；b（ii）MN的上尖端；b（iii）MN的主體；b（iv）MN的表面。c）PCL涂層DLMNP的數字顯微鏡圖像。d）DLMNP的SEM圖像：d（i）單個MN；d（ii）MN上尖；d（iii）MN體；d（iv）MN表面。e）DLMNP的熒光圖像：外層包埋FITC（綠色），內部MN包埋羅丹明6G（紅色）；e（ii）它們的重疊部分（黃色）。f和f（i）不同視圖下DLMNP的三維共焦重建圖像。g-i）不同時間（0、2、4、6、8h）乙醇蒸氣處理DLMNP內SF MN的理化特征：（g）SF MN的FTIR；（h）SF MN的XRD；（i）SF MN的溶解譜。j）DLMNP的機械穿透曲線和j（i）經DLMNP處理的皮膚樣本圖片。k）隨著時間的推移，在37℃ PBS（pH=7.4）中培養的DLMNP體外積累aPD-1釋放。l）aPD-1從DLMNP釋放后的生物活性。

為了評價SMND的體內抗癌和抗CSCs效率，研究人員采用B16F10-CSCs荷瘤小鼠模型模擬臨床轉移性黑色素瘤。注射aPD-1的小鼠在最初的8天內腫瘤生長延遲，而隨后腫瘤明顯復發，在AB-MSN組也發現了類似的趨勢。DLMNP聯合AB-MSN組和DLMNP聯合aPD-1組腫瘤消退作用有限，腫瘤復發是由于CSCs的異質性導致的免疫耐受所致。相反，經aPD-1 + AB-MSN治療的DLMNP小鼠表現出持續的腫瘤抑制作用，一些腫瘤在治療后甚至消失。14天后，經aPD-1 + AB-MSN治療的DLMNP小鼠的腫瘤重量（39.8 ± 21.5mg）遠小于經AB-MSN治療的DLMNP（671.6 ± 24.7mg）和經aPD-1治療的DLMNP（601.4 ± 31.7mg）。血紅素和伊紅（H&E）染色圖像顯示，在aPD-1 + AB-MSN的DLMNP治療的動物模型的大部分腫瘤區域出現廣泛的組織病理學和壞死。結果表明，免疫治療和氫治療的協同抗腫瘤作用比單一治療更有效。不同處理后未觀察到明顯的體重、減輕或其他臨床毒性跡象，這表明DLMNP聯合aPD-1 + AB-MSN治療可能是一種安全的治療策略，具有很大的臨床潛力。為了進一步證實DLMNP在腫瘤部位的持續釋放aPD-1，研究人員在不同時間點收集治療過的腫瘤進行免疫染色。aPD-1組在給藥日（第0天）腫瘤部位出現較強的抗體信號。DLMNP傳遞的aPD-1在3天內產生連續信號，具有持續免疫治療的潛力，并極大地避免了重復穿刺以保持足夠的藥物濃度。

圖4 SMND的體內協同抗癌效率。a）小鼠背側及相關皮膚（紅圈內區域）經皮注射SMND的DLMNP。b）對B16F10-CSCs小鼠模型進行不同處理的示意圖。c）小鼠治療后腫瘤的代表性照片。d）腫瘤生長曲線和e）B16-CSCs荷瘤小鼠在治療14天后的腫瘤重量。f）治療14d后切除腫瘤代表性H&E染色圖像。g）B16 CSCs荷瘤小鼠治療14天內體重。h）不同時間點aPD-1處理腫瘤和aPD-1 + AB-MSN處理DLMNP的免疫熒光染色（綠色：aPD-1；藍色：細胞核）。i）熒光圖像分析的平均熒光強度。

綜上所述，研究人員開發了一種可穿戴的蠶絲基微針裝置（SMND），用于智能給藥，并評估了其協同免疫和氫治療黑色素瘤CSCs的效果。SMND的雙層MN貼片（DLMNP）不僅可以實現熱響應H?釋放，還可以實現aPD-1的持續傳遞，用于免疫治療。這種協同CSCs治療策略是雙重保險。首先，H?的熱響應釋放阻止了腫瘤細胞的增殖和遷移。此外，其較強的穿透能力可以消除腫瘤內部的CSCs，抑制CSCs的進一步分化。其次，aPD-1的持續釋放阻斷腫瘤免疫逃逸。氫處理后存活的腫瘤細胞進一步被T細胞捕獲，從而有效避免腫瘤轉移和復發。最后，患者可以在家通過智能手機通過SMND的智能電子元件管理給藥過程，避免了醫護人員的護理需求。在B16F10-CSCs小鼠黑色素瘤模型中，協同治療實現了令人滿意的抗CSCs效果，同時全身毒性和副作用最小。

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https://doi.org/10.1002/adfm.202206406

審核編輯 ：李倩