干細胞樣腫瘤細胞的Midkine表達驅動mTOR

抑制和免疫抑制微環境的持續

（一）

摘要

mTORC1在多種癌癥類型中異常活躍。此研究對結節性硬化綜合癥(TSC)與mTORC1極度活躍相關的腫瘤進行了單細胞轉錄組分析、配對T細胞受體(TCR)測序和空間轉錄組分析，并通過腫瘤調節的免疫抑制性巨噬細胞確定了一種與T細胞功能障礙有關的干細胞樣腫瘤細胞狀態（SLS）。雷帕霉素及其衍生物(rapalogs)是治療TSC腫瘤的主要藥物，干細胞樣腫瘤細胞在體外表現出雷帕霉素耐藥，這讓研究者聯想到這些藥物對患者細胞的抑制作用。促血管生成因子midkine (MDK)在SLS群體中高度表達，并在SLS優勢樣本中與內皮細胞的富集相關。MDK抑制與雷帕霉素在體內外協同抑制TSC細胞系的生長。綜上所述，本研究提示mTORC1高活性的干細胞樣狀態腫瘤細胞通過免疫抑制，存在一種自分泌雷帕霉素耐藥機制和旁分泌腫瘤生存機制。

研究內容

AML 和 LAM的單細胞分析

研究者對腫瘤切除時獲得的6個腎性AML腫瘤和4個正常組織進行scRNA-Seq和scTCR-Seq（圖1a）。在肺移植時獲得的5個LAM組織也進行了scRNA-Seq。過濾掉低質量的細胞后，共分析了來自AML的108,071個細胞和來自匹配的正常腎臟的33,136個細胞；分析了LAM肺部樣本的42,202個細胞。AML組織和正常組織的免疫和基質區的主要細胞類型見圖1b, c。正常腎臟含有49%的上皮細胞，而AML中只有1.1%的上皮細胞（圖1d）。與正常組織相比，許多免疫類細胞在腫瘤組織中被富集，包括巨噬細胞（18.3% vs 2.7%）、樹突狀細胞（4% vs 0.7%）和T細胞（32.6% vs 14.1%）。在LAM組織中發現的主要細胞類型包括免疫細胞（T細胞、NK細胞、B細胞、巨噬細胞和單核細胞）、間質細胞、上皮細胞和內皮細胞（淋巴細胞和血液）（圖1e）。

AML細胞中的通路和遺傳調控網絡的圖譜

對間質細胞群的重新聚類顯示了來自正常腎組織和AML腫瘤組織的獨立細胞群（圖1f）。除了AML細胞（如上所述），該集群還包含腫瘤相關的成纖維細胞（TAF）。通過Seurat的差異基因表達分析發現，與TAF和正常腎臟相比，160個基因在腫瘤細胞中唯一上調，包括以前報道的基因（如GPNMB、SQSTM1/p62、MMP2、PTGDS）和參與腫瘤轉移的基因（如MMP11、MDK、DCN、PDPN）（圖1g，補充圖3b，補充數據1）。與匹配的正常間質細胞相比，兩個長的非編碼RNAs（lncRNAs）（MALAT1，NEAT1）在腫瘤細胞和腫瘤相關的成纖維細胞中都被上調（圖1g和補充圖3c），表明AML細胞重塑了成纖維細胞。為了確定AML細胞與TAF和正常腎臟的不同調節途徑，研究者使用了基因集變異分析（GSVA）。標志性的基因集分析（包含50個基因集）確定了參與膽固醇平衡的基因是AML細胞中上調最多的途徑，而第二大上調途徑是mTORC1信號傳導，這是在AMLs和LAM中TSC2損失的一個眾所周知的生化效應（圖1h）。研究者使用SCENIC分析發現：在AML細胞中更多的調控因子被上調。該分析還確定了與AML相關的轉錄因子和調節子，包括參與表觀遺傳調控的幾個因子，如HDAC2、SIRT6、FOXN3、MEF2A（圖1i，補充圖3d。補充資料2、3）。所關注的具體基因包括MDK（在此新發現的在AML中高表達的基因）和GPNMB（AML的一個已知標記）。研究者使用RNA原位雜交，在AML腫瘤中檢測到MDK的表達，但在鄰近的正常腎臟中沒有檢測到（圖1j）。MDK是一種肝素結合的生長因子，能促進細胞生長和血管生成。

圖1. 血管肌瘤（AML）和淋巴管瘤病（LAM）的單細胞圖譜

AML腫瘤細胞表現為兩種主要狀態:干細胞樣和炎性

對6596個AML細胞進行重新聚類顯示了四個細胞群（圖2a，b）。Custer 1顯示中胚層特異性轉錄因子21（TCF21）的相對高表達，這是平滑肌細胞表型調節的主調控因子（圖2b，補充圖4b）。他們注意到幾個基因（SOX4，TCF4）（圖2b，補充圖4c），已知是干細胞標志物。研究者計算 "干性評分"并發現：群組1顯示出最高的干性分數（圖2c），并顯示出炎癥基因的高表達（圖2b，補充圖4e）?；谶@些特征，他們將聚類1定義為干細胞樣狀態（SLS），聚類2定義為炎癥狀態（IS）。嘌呤相關的代謝與mTORC1途徑有關，高水平的嘌呤核苷酸是維持癌癥干性所必需的，而外部補充次黃嘌呤則會促進腫瘤干性。研究者從單細胞轉錄組中產生了偽Bulk RNA-seq數據，并發現與正常對照組相比，兩種腫瘤細胞狀態下嘌呤途徑中鳥嘌呤/鳥苷的代謝都升高了（圖2d）。

人們越來越認識到，缺氧的微環境以及轉移過程中誘發的壓力會引發休眠狀態，使腫瘤細胞對藥物治療和壓力產生抗性。研究者進一步分析一組休眠標記基因，發現在SLS群體中高表達（群集1），包括轉錄因子NR2F1（圖2e）。NR2F1通過整合靜止和生存的表觀遺傳程序，成為誘導和維持腫瘤干細胞休眠的一個關鍵節點。Regulon分析證實，NR2F1 regulon活性在SLS（群集1）中被上調（圖2f）。并且雌二醇處理增加了NR2F1的表達和regulon活性（圖2g）。研究者通過對SLS和IS的marker（MDK和TAGLN，圖2i）以及Cathepsin K（AML/LAMmarker基因）進行共染色，在腫瘤樣本中鑒定到了SLS和IS群體。量化顯示MDK和TAGLN幾乎沒有共定位，而MDK與CTSK或TAGLN與CTSK廣泛共染（圖2j），支持存在兩個不同的AML細胞群，MDK+和TAGLN+。

LAM中出現的細胞群與AML中觀察到的兩種類型相似

遺傳學研究顯示，AML和LAM的細胞來自一個共同的前體細胞。為了確定在AML中發現的兩種細胞狀態是否存在于肺部LAM中，研究者使用與AML相同的標記基因組和方法分析了五個LAM肺部的57186個細胞，共鑒定了375個LAM細胞（圖1e）并聚類成了4個細胞群（圖2k）。與AML相似，一個集群表達SLS/調節性平滑肌標志基因（集群2），另一個集群表達IS/收縮性平滑肌標志基因（集群1）（圖2l）。還確定了一個表達所有這些基因的中間狀態（簇0）。SLS群體和中間狀態顯示出較高的干性評分（圖2m）。此外，與SLS AML細胞一樣，LAM細胞的SLS群也有NF2F1表達和調節子活性的上調（圖2n）。在LAM細胞中，VEGFD（一種有效的LAM生物標志物）的表達遠遠低于MDK（一種有效的血管生成和淋巴管生成的生長因子）（圖2o），表明MDK在LAM相關的淋巴管生成中的潛在作用。

圖2. AML和LAM細胞狀態的異質性

未完待續

那么AML細胞的干細胞樣細胞群與雷帕霉素耐藥相關性、異質性腫瘤細胞狀態對內皮細胞的重塑以及scRNA-Seq和scTCR-Seq的綜合分析如何揭示了SLS優勢腫瘤的T細胞功能障礙和抑制的克隆擴展請見下回詳解。

SBC 單細胞測序平臺

單細胞轉錄組測序（Single-cell RNA-sequencing）是指在單細胞水平上對RNA進行高通量測序和分析的新技術。公司（中心）建立的單細胞測序的主流平臺——10x Genomics Chromium，可提供大規模、靈活、全面的單細胞測序服務，包括單細胞轉錄組、單細胞免疫組庫、單細胞ATAC-seq、單細胞ATAC+轉錄組測序等。經過多年的積累，現已形成從樣本保存、運輸、單細胞懸液制備，到單細胞分選、建庫和數據分析的一站式解決方案。目前已為來源于人、小鼠、大鼠、斑馬魚等多種物種的臨床和科研樣本提供了單細胞測序和數據分析服務。

SBC 空間轉錄組測序平臺

空間轉錄組學技術能夠測定組織樣本中（冰凍和石蠟樣本）的所有基因表達圖譜，并定位具體發生的位置信息。公司（中心）建立的10x Genomics Visium空間轉錄組測序平臺，無需進行目標預設就可以在空間上實現組織中基因表達的可視化。通過數據分析和數據可視化，將基因表達數據映射到圖像上，實現對同一樣品基因表達和細胞組成空間結構的表征，以從組織切片中獲得生物學的全貌。