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摘要本文采用毛細管對流 PCR 平臺將毛細管安裝在溫度為 95°C 的加熱器上，通過自然對流實現 PCR 循環。

毛細管底部(高溫區域) 樣品通過浮力驅動上升，同時使模板變性。樣品上升過程中，因周圍空氣的冷卻使其溫度下降。

當樣品到達毛細管頂部(低溫區域)時，開始進行退火和延伸，隨后 DNA 模板下沉并再次加熱。

引物和擴增子設計對 DNA 擴增成功與否至關重要。

術語 CCPCR :Capillary Convective PCR

簡介

由溫度梯度內的流體密度變化引起的自然對流可用于 DNA 擴增。當樣品在自然對流作用下在不同溫度區域重復循環時，樣品可能會在一次循環中經歷 PCR 擴增的三個步驟----核酸變性，退火和延伸。

對流 PCR 可以將擴增時間從數小時縮短至 30-40 分鐘。但是，當前的對流 PCR 系統使用兩個或多個獨立的溫度控制器和復雜的系統設計，需要特定形狀的管道或額外的腔室才能使流體完全循環。

此外，某些操作需要特定的技巧，如從細管中裝載和卸載試劑以及密封管的兩端而不將氣泡困在里面。每一步操作對成功擴增都至關重要。

此外，因沒有研究對比傳統 PCR 和對流 PCR 在引物和擴增子設計上的差異，從而限制了對流 PCR 的廣泛應用。

毛細管對流 PCR 平臺

如圖 1 所示，毛細管對流 PCR 采用帶有溫度反饋控制功能的熱浴鍋作為熱源。樣品容器為一種具有封閉式底部的商業玻璃毛細管 (100 ul)，長 51 mm，其內徑和外徑分別為 2.3 mm 和 3.2 mm。

將兩個具有不同鉆孔深度（4 mm 和 30 mm）的加熱塊放入溫度維持于 95°C 的熱浴鍋中。(有意思，也就是它的熱源是水唄)

首先將裝有樣品的玻璃毛細管放入 30 mm 深的加熱塊上。在 10 min 內通過熱傳導將整個試管完全加熱以激活 Taq DNA 聚合酶。

之后，將管子轉移到 4 mm 深的加熱塊上，并采用塑料毛細管支架支撐。僅在底部加熱試管 30 min，便可進行 DNA 擴增。

圖 1 兩個加熱塊放置在 95° 的熱浴鍋中

樣品上部覆有10μL 礦物油。2ul 的 CPCR 產物采用瓊脂糖凝膠電泳分析。

粒子圖像測速和溫度測量

通過粒子圖像測速技術(PIV) 對毛細管 (75ul) 中流體的流動進行了觀察。其中，h / d = 7.7 ( h / d 表示毛細管中樣品的高度與毛細管內徑之比)。

試劑采用去離子水，直徑 50μm 的polystyrene polyamide particles 作為 trace particle (:1005 )。

預熱 10 min 后，采用 Nd：Yag 激光 ( λ= 532 nm ) 作為激發光，示蹤顆粒在 ?585 nm 處發熒光。圖像以每秒 15 幀的速率在 CCD 相機上被捕獲。

試劑和油之間的溫度（）采用溫度記錄儀測量。

結果與討論

如圖 2A 所示，在此平臺中，當毛細管從下端加熱，上端被周圍的空氣冷卻時，試劑中產生的溫度梯度引起自然對流，使得試劑循環通過 DNA 擴增所需的熱梯度。

成功應用此平臺有如下兩個挑戰： (1)當只有一個溫度控制裝置時，需保證變性，退火和延伸所需流場和溫度場的穩定性; (2)設計適合與平臺產生的溫度梯度一起使用的引物和擴增子。

圖 2A

圖 1B (頂部) 顯示了從毛細管下端加熱，其內部試劑循環一圈溫度的變化情況。(the hottest temperature) 位于毛細管底部，(the lowest temperature)位于毛細管上方 (油和試劑接觸的部分)。為確保 PCR 擴增的三個步驟發生在毛細管內部，(擴增子的變性溫度)應低于，(引物的解鏈溫度；melting temperature of the primer)應高于。顯然，在變性/退火/延伸步驟中有效反應的時間取決于溫度差：和。 Primers with melting temperatures in the range of 52-58°C generally produce the best results.

圖 2B CCPCR (上圖) 和傳統 PCR (下圖) 之間樣品溫度曲線的比較。傳統 PCR 在每一步擴增中都保持恒定的溫度，并且整個管中一次只能執行一個擴增步驟，而 CCPCR 的溫度曲線沿毛細管的長度方向平滑變化，同時 PCR 擴增的不同步驟同時進行。

為了延長擴增的持續時間，可以通過調節熱系統或通過設計具有高解鏈溫度的特異性引物來調節和。如圖 3 所示，采用不同體積的樣品測量了油和試劑接觸部分的溫度。結果表明，樣品體積越大，越低。理論上講，可以增加更多的樣本量來降低以提供更長的有效擴增時間。

圖 3 當熱浴鍋溫度設定在95°C時，油-樣品區的溫度隨著樣品體積的增加而降低

但是，如果流體路徑過長，可能會激發自然對流中的第二種運動模式：也就是說，流動模式可能會分成兩個或多個垂直循環路徑。對于更長的毛細管，流體流動可能會變得更加紊亂。應避免這些情況，以確保流體運動模式的穩定性。進一步，腔室體積變大會增加所需 PCR 試劑的量進而增加反應成本。因此，選擇了體積為 75μL 的毛細管來維持穩定的熱對流環境。

圖 4 (I) 將底部厚度為 3mm 的商用玻璃毛細管放在具有直徑 3.2mm ，深 4mm 孔的鋁塊中加熱. (II) 一個塑料毛細管支架防止毛細管傾斜(支架高度(HH): 26 mm；礦物油: 10μL). (III)采用 PIV 進行流場分析. (IV) FLUENT 模擬顯示當樣品高度為 18 mm (體積為75μL) 時，毛細管中流場的穩定循環狀況.

如圖 4 所示，采用 PIV 可視化了毛細管 (直徑: 2.3 mm) 中的流體流動情況，并通過 FLUENT 仿真模擬軟件進行了確認。上述設計解決了流體流動產生的第一個挑戰和成功擴增所需的溫度場。

圖 5 h/d = 7.7, Ra = 時，毛細管對應的溫度場和速度場分布. 對于第二個問題，在固定溫度條件下(°C , °C)，引物的最佳值應該被測試。本文設計了 7 個在 57–80°C 范圍內具有不同的引物對，通過上述平臺擴增 HBV。如圖 6 凝膠電泳數據所示，CPCR不能使用≤ 70°C 的引物擴增靶 DNA，但 ≥ 72°C 的引物卻可以成功擴增靶 DNA。采用 ≥ 76°C 的引物，電泳 DNA 條帶的強度似乎更強。

圖 6

除了之外，用于變性的是影響 CPCR 擴增的另一個因素。如果試管中的太接近，CPCR 將失敗，因為雙鏈 DNA 不可能完全變性，這將不允許引物有效地退火至模板 DNA。這會降低平臺檢測長擴增子的能力，因為較長的長度或較高的 GC 含量通常會伴隨較高的變性溫度。如圖 7I 所示，本文對范圍為 86–91°C 的四個 HBV 擴增子進行了測試，發現 CPCR 可以在 < 87°C (??> 8°C) 的情況下擴增兩個擴增子 (122 和 169 bp)。 > 90°C 時 (< 5°C) 擴增其它兩個擴增子 (188 和 222 bp)。為了增加???,可以將加熱溫度從 95 °C 調整為 99 °C。在圖 7BII 中可得出，??> 90°C 時，188 和 222 bp 的擴增子均出現弱帶，表明較大的值可以成功擴增具有較高值的 DNA 模板。應當注意，圖 7BII 中122 和169 bp 擴增子的條帶均比圖 7BI 中的條帶弱。原因可能為，當 ≤ 86°C 時，這兩個擴增子的引物退火效率會因油-試劑處溫度的升高而降低。

圖 7

也可以使用化學方法通過添加二甲基亞砜 (DMSO) 來降低擴增子的，從而增強 DNA 二級結構的變性。但是，DMSO 也會影響模板上的引物退火，因為引物的降低，在某些情況下可能會對 CPCR 擴增產生不利影響 (如圖 7BIII)。保持相同的熱場(°C, °C) 對于在毛細管中保持一致的流場和溫度場分布很重要，而且如果可以選擇具有所需的擴增子而不改變引物的會更好。選擇低是擴增長擴增子的策略，但存在加熱器溫度必須保持在 95°C 的限制。因此，本文嘗試使用 CPCR 擴增 7 個不同長度的擴增子，從 208 到 816 bp。

圖 8

如圖 8 所示，CPCR 可以擴增 DNA≤500 bp 的長度。這揭示了和在 CPCR 中的重要性，而傳統 PCR 則更多地依賴于。總之，對于任何 DNA 模板，CPCR的經驗法則是采用具有高的引物和低的擴增子。為了證明這一規則，如圖 9 所示，本文選擇了幾種 ≤500 bp (≤ 87°C，≥ 76°C ) 的不同病毒擴增子進行檢測，成功的實現全部擴增。

圖 9

如圖 10 所示，HBV 質粒DNA的測試靈敏度為每個反應 30 份。高拷貝和低拷貝 HBV DNA 序列 (分別為 3000 和 3??????0??????拷貝/管) 僅在 30 分鐘內通過 CCPCR 擴增。

圖 10 (上圖) 傳統 PCR (圖片右半部分) 和 CCPCR (圖片左半部分) 擴增從到 3 的初始 DNA 拷貝數。傳統 PCR 的總反應時間為 1 小時 40 分鐘，CCPCR 為 30 分鐘。(下圖)使用高和低DNA濃度通過 CCPCR 進行擴增的時間流程 (初始 DNA拷貝數：3000，左；30，右) 本文研究表明，這種簡單的擴增方法確實需要對擴增子和引物 (高引物和低擴增子) 進行重新設計和優化，以使其具有與傳統 PCR 相當的性能。這種優化增加了和的相對溫差，從而延長了變性/退火/延伸反應的空間和時間。