基因療法能從根本上補(bǔ)充或修復(fù)缺陷基因，恢復(fù)健康基因的正常生物學(xué)功能，具有不可比擬的治療優(yōu)勢(shì)。腺病毒或腺相關(guān)病毒（AAV）已經(jīng)成為預(yù)防感染、嚴(yán)重疾病和死亡的理想基因治療和疫苗載體。

載體進(jìn)入體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)并建立免疫記憶需要一種具有傳染性的活性病毒疫苗。傳統(tǒng)的定量檢測(cè)方法中，無(wú)論是靈敏度較高的qPCR檢測(cè)，還是傳統(tǒng)免疫學(xué)原理Elisa檢測(cè)等，僅可以定量病毒載體的總濃度。因受到病毒載體碎片干擾，而無(wú)法精確測(cè)定病毒疫苗載體的效價(jià)濃度，進(jìn)而影響基因藥物或疫苗的生產(chǎn)質(zhì)量控制以及精準(zhǔn)給藥。因此，迫切需要一種可準(zhǔn)確測(cè)定病毒載體的濃度和存活力的新技術(shù)。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，針對(duì)上述問(wèn)題，華中科技大學(xué)劉鋼教授和黃麗萍博士團(tuán)隊(duì)與華中農(nóng)業(yè)大學(xué)金梅林教授、張強(qiáng)副教授團(tuán)隊(duì)合作，研發(fā)了一種具有納米級(jí)多功能機(jī)器人手結(jié)構(gòu)的納米等離子體（Nano RHB）生物傳感器，用于快速、無(wú)損和特異性地捕獲和定量檢測(cè)腺病毒顆粒。該傳感器可應(yīng)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)基因治療和病毒疫苗載體數(shù)量和質(zhì)量，評(píng)估病毒載體的感染活力。研究成果以“Versatile nanorobot hand biosensor for speci?c capture and ultrasensitive quanti?cation of viral nanoparticles”為題發(fā)表于Materials Today Bio期刊。

在該研究中，研究人員首先開(kāi)發(fā)了一種基于非常光透射（EOT）效應(yīng)的無(wú)標(biāo)記Nano SPR生物傳感器。該生物傳感器可以被非偏振光激發(fā)，并且不需要復(fù)雜的光學(xué)設(shè)備。然后通過(guò)在納米杯陣列芯片上直接實(shí)施金種子生長(zhǎng)法，設(shè)計(jì)了一種具有納米機(jī)器人手的新型多功能Nano SPR生物傳感器。由于其特殊的納米杯結(jié)構(gòu)作為種子模板，通過(guò)聚多巴胺分子在芯片表面生成了不同形狀的分枝狀金納米結(jié)構(gòu)。這些分支金納米結(jié)構(gòu)的功能類似于智能機(jī)器人手，從而增強(qiáng)SPR共振效應(yīng)以提高芯片的靈敏度，同時(shí)增加表面積以提高芯片修飾效率。將這些超靈敏生物傳感器集成到標(biāo)準(zhǔn)96孔板或32孔板中，可以直接監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)結(jié)合曲線，并使用微量樣品定量檢測(cè)腺病毒載體或疫苗。

使用Nano RHB平臺(tái)一步快速定量病毒顆粒

研究結(jié)果表明，基于該新型傳感器，將重組人CAR、FX蛋白或抗腺病毒六鄰體蛋白抗體固定在NanoRHB的表面，這些配體可以分別結(jié)合腺病毒的纖維蛋白（病毒衣殼上突出的刺突）和六鄰體蛋白（主要的衣殼蛋白），通過(guò)腺病毒特異性結(jié)合的CAR/FX蛋白相互作用可快速檢測(cè)腺病毒的生存活力和濃度，在5分鐘內(nèi)同時(shí)高通量檢測(cè)多達(dá)96個(gè)樣品，比傳統(tǒng)病毒滴度檢測(cè)方法和PCR方法更高效快捷。

基于CAR包被的Nano RHB平臺(tái)在5分鐘內(nèi)無(wú)標(biāo)記檢測(cè)腺病毒

此外，研究人員還使用凍干技術(shù)將CAR標(biāo)記的金顆粒整合到單克隆抗體修飾的Nano RHB平臺(tái)上，檢測(cè)靈敏度可以進(jìn)一步提高5倍。研究結(jié)果顯示，金顆粒偶聯(lián)的Nano RHB的獨(dú)特SPR效應(yīng)可實(shí)現(xiàn)一步式夾心法進(jìn)行高靈敏度和快速的腺病毒載體顆粒評(píng)估，而不需要洗滌步驟和復(fù)雜的樣品預(yù)處理。該種超靈敏金納米分支結(jié)構(gòu)修飾的生物芯片，不僅可以快速有效地評(píng)估腺病毒載體的活力，還可以通過(guò)一步夾心法提高檢測(cè)靈敏度至100 copies/mL。

研究人員進(jìn)一步將采用Nano RHB平臺(tái)檢測(cè)26個(gè)細(xì)胞上清液樣品，結(jié)果顯示與傳統(tǒng)qPCR和病毒滴度檢測(cè)分析的結(jié)果非常一致。Nano RHB傳感器分析顯著縮短了總檢測(cè)時(shí)間，從幾天和幾小時(shí)縮短到幾分鐘，并通過(guò)直接結(jié)合病毒表面蛋白來(lái)同時(shí)快速檢測(cè)病毒生存力和濃度，從而提高了檢測(cè)能力。該新型檢測(cè)平臺(tái)也展示出對(duì)不同類型的病毒載體和假病毒的高特異性。

研究結(jié)果顯示Nano RHB平臺(tái)是一種有前途的高通量生物檢測(cè)工具，用于高效和超靈敏地評(píng)估疫苗和基因遞送載體，用于大規(guī)模腺病毒載體疫苗的快速質(zhì)量控制，亦可用于其他基于病毒載體和基因載體的檢測(cè)分析。

研究團(tuán)隊(duì)已實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)的轉(zhuǎn)化，基于Nano SPR技術(shù)開(kāi)發(fā)的一種腺相關(guān)病毒（AAV-2）定量檢測(cè)試劑盒，能準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、高通量的檢測(cè)細(xì)胞上清中AAV-2病毒含量。

AAV-2病毒定量檢測(cè)試劑盒的原理是AAV-2病毒上的衣殼蛋白和生物芯片表面AAV-2單抗結(jié)合后與芯片納米孔產(chǎn)生等離子共振效應(yīng)，引起特定波長(zhǎng)處吸光度的改變。該波長(zhǎng)處的吸光度的高低與樣本中的AAV-2病毒含量成正比。故可利用已知濃度的病毒樣品在Nano SPR芯片的特定波長(zhǎng)處的吸光度變化，建立吸光度變化值與濃度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出待測(cè)樣本中的AAV-2病毒含量。

AAV作為基因治療的明星載體，是目前基因治療中最常用的載體，準(zhǔn)確的滴度檢測(cè)是AAV基因治療藥物質(zhì)控的重要組成部分，也是開(kāi)展臨床研究的前提條件。

AAV-2病毒定量檢測(cè)試劑盒可搭配量準(zhǔn)多功能分子檢測(cè)儀（WeSPR 100或WeSPR HT96）使用，一步加樣，15min即可出結(jié)果，能準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、高通量的檢測(cè)細(xì)胞上清中AAV-2病毒含量。大大簡(jiǎn)化了AAV開(kāi)發(fā)者的工作流程。

在基因治療、抗病毒疫苗開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用前景。基因治療或疫苗開(kāi)發(fā)過(guò)程中，對(duì)AAV衣殼濃度進(jìn)行完整、精確的測(cè)定，是前期研發(fā)，中期篩選中獲得可靠數(shù)據(jù)，后期治療中能夠安全有效給藥的必要條件。同時(shí)，測(cè)定AAV分離純化過(guò)程中不同階段的病毒濃度、優(yōu)化克隆、提高產(chǎn)量也十分重要。

華中科技大學(xué)博士生李睿、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士生趙亞、華中科技大學(xué)博士生樊洪利為論文的共同第一作者，華中科技大學(xué)的黃麗萍博士、劉鋼教授及華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的金梅林教授、張強(qiáng)副教授為該文的共同通訊作者。該工作得到了科技部國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金委的資助。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2022.100444

審核編輯 ：李倩