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超平整石墨烯電鏡載網利于高信噪比和高分辨率的冷凍電鏡成像

led13535084363 ? 來源:光行天下 ? 作者:光行天下 ? 2022-12-20 10:32 ? 次閱讀

單顆粒冷凍電鏡技術是揭示生物大分子精細結構和反應機理的重要手段之一。在樣品制備過程中,均勻薄冰層的制備能夠顯著提高冷凍電鏡成像質量,尤其是對于分子量較小的生物大分子(小于100 kDa),因為冰層過厚會嚴重影響信噪比,無法實現高分辨率結構重構。然而,樣品冰層的厚度和均一性難以精確控制,是目前高分辨冷凍電鏡成像的主要挑戰之一。

北京大學彭海琳教授課題組與清華大學王宏偉教授課題組,以及北京大學韋小丁教授課題組合作,揭示了冷凍電鏡樣品支撐膜的表面粗糙度和冰層均一性的關系,并開發了超平整石墨烯電鏡載網,解決了均勻薄冰的制備難題。實驗表明,超平整石墨烯支撐膜有助于制備更薄更均勻的玻璃態冰,背景襯度低,有利于高信噪比和高分辨率的冷凍電鏡成像。使用超平整石墨烯支撐膜,他們對三種分子量較小的蛋白質——鏈霉親和素蛋白(52 kDa)、血紅蛋白(64 kDa)和甲胎蛋白(67 kDa)進行結構解析,分別得到了2.22a74b590-7f8e-11ed-8abf-dac502259ad0.png、3.52a74b590-7f8e-11ed-8abf-dac502259ad0.png和2.62a74b590-7f8e-11ed-8abf-dac502259ad0.png的高分辨率重構。他們還證明該超平整石墨烯載網在冷凍電子斷層掃描重構(cryo-ET)等領域有良好的應用前景。 ? ?

研究團隊基于超平整石墨烯單晶晶圓和“面對面”超潔凈無膠轉移方法,成功實現了超平整懸空石墨烯電鏡載網的批量化制備,單層石墨烯懸空膜完整度高達98%,平均表面粗糙度低至0.7nm。原子力顯微鏡納米壓痕技術的力學表征結果表明,超平整石墨烯支撐膜具有接近于石墨烯理論值的楊氏模量和斷裂強度,遠高于粗糙起伏的石墨烯支撐膜。

他們將超平整石墨烯載網用于冷凍電鏡成像中,發現均勻薄冰能顯著提高成像質量。一方面,超平整懸空石墨烯的預應力使得冰層在電子束輻照下不易發生翹曲,有效抑制了樣品顆粒在成像時的漂移。另一方面,在不同的傾轉角度下(-60°至60°),石墨烯表面均無褶皺結構,避免了高角度成像時褶皺對樣品信號的遮蔽。經過測量,利用超平整石墨烯支撐膜所制備的冰層厚度約為20nm,比較均勻,既可有效封裝生物大分子顆粒,也不會過多引入額外的背景噪音。并且,大多數生物大分子顆粒吸附于石墨烯表面,幾乎處于同一高度,降低了成像時同一視野下局部欠焦值的差異。與粗糙起伏的石墨烯對比,超平整石墨烯支撐膜保證了高質量數據的收集,提升了成像效率。

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圖1.懸空石墨烯支撐膜的平整度影響冰層厚度均一性和成像質量

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圖2.超平整石墨烯載網的設計、制備與力學性質表征

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圖3.超平整石墨烯顯著提高冷凍電鏡成像質量,成功解析小分子量蛋白的高分辨三維結構

該研究以“超平整石墨烯制備均勻薄冰用于高分辨冷凍電鏡成像”(Uniform thin ice on ultraflat graphene forhigh-resolution cryo-EM)為題,于12月15日發表在《自然·方法學》(Nature Methods)。北京大學化學與分子工程學院彭海琳教授、清華大學生命科學學院王宏偉教授和博士后劉楠,以及北京大學工學院韋小丁教授為論文共同通訊作者,北京大學化學與分子工程學院博士畢業生鄭黎明、清華大學生命科學學院博士后劉楠、北京大學化學與分子工程學院2020級博士生高嘯寅以及北京大學工學院博士畢業生朱文清為論文共同第一作者。

審核編輯:郭婷

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原文標題:超平整石墨烯用于高分辨冷凍電鏡成像

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