急性心肌梗死(AMI)是由冠狀動脈粥樣硬化引起的健康問題,有著較高發(fā)病率和死亡率。心電圖(ECG)是目前用于測量和診斷心臟節(jié)律異常的主要方法,在心臟病的診斷中具有重要地位。但局限于許多AMI早期患者沒有明顯的ECG改變,ECG往往無法診斷早期AMI。
為了克服這些缺點(diǎn),對AMI的生物標(biāo)志物進(jìn)行有效檢測成為了很好的策略。肌紅蛋白是一種重要的細(xì)胞質(zhì)血紅素蛋白,存在于所有肌肉中。當(dāng)心肌壞死時,血清肌紅蛋白水平在1~3 h內(nèi)升高,通常在6~9 h時內(nèi)達(dá)到峰值,在24 h內(nèi)恢復(fù)正常。因此,當(dāng)肌紅蛋白含量升高時,可以提示早期心肌梗死癥狀,是一種具有較高特異性和敏感性的AMI的生物標(biāo)志物。因此,在生命科學(xué)領(lǐng)域,肌紅蛋白的檢測方法有著較為廣泛的研究。
時間分辨熒光側(cè)流層析技術(shù)是一種靈敏度高、檢測時間短、可用于現(xiàn)場篩查的定量檢測技術(shù),盡管其具有諸多優(yōu)勢,但也存在一些不足:對免疫層析技術(shù)來講,測試條之間的重復(fù)性問題是最大的挑戰(zhàn),而重復(fù)性差大部分原因在于該技術(shù)采用層析膜以及其他薄膜進(jìn)行檢測,需要保證液體流動一致性。
據(jù)麥姆斯咨詢報道,針對上述不足,湖南大學(xué)唐昊課題組研究設(shè)計了一種時間分辨熒光結(jié)合微流控芯片技術(shù),并將其作為肌紅蛋白的便捷檢測方法,以期解決重復(fù)性差的問題,并提高分析過程的自動化程度。相關(guān)研究成果以論文形式于近期發(fā)表于《中國科技論文在線精品論文》期刊。
該檢測方法原理如圖1所示。首先,將氨基化玻片作為肌紅蛋白抗體的固相載體,利用馬來酰亞胺與巰基的邁克爾加成法實現(xiàn)肌紅蛋白抗體的固定。同理可將肌紅蛋白抗體Myo-Ab3固定于時間分辨熒光微球(TRFM)上。隨后,將抗體化玻片預(yù)先埋入微流控芯片中,并通過抗原-抗體的特異性結(jié)合向已標(biāo)記肌紅蛋白抗體Myo-Ab3的時間分辨熒光微球中加入100 μL肌紅蛋白抗原Myo-Ag1,得到時間分辨熒光微球-肌紅蛋白抗體的復(fù)合結(jié)構(gòu)。
接著,將反應(yīng)混合液從進(jìn)樣口加入到進(jìn)樣室后垂直放置微流控芯片,通過重力作用使混合液流至玻片處與其反應(yīng),得到時間分辨熒光微球-抗體1-抗原-抗體2-玻片的雙抗體夾心復(fù)合物,此反應(yīng)過程持續(xù)2 min,反應(yīng)溫度為37℃。該復(fù)合物經(jīng)過持續(xù)2 min的洗滌過程后可直接在玻片上進(jìn)行檢測,實驗操作簡單。
圖1 時間分辨熒光結(jié)合微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于肌紅蛋白的便捷檢測原理示意圖
引入微流控芯片后,研究人員利用免疫色譜讀取儀測量熒光強(qiáng)度考察了該體系的可行性。結(jié)果如圖2a所示,沒有肌紅蛋白抗原存在時,玻片的熒光值較低,說明由于缺少抗原抗體的特異性結(jié)合,玻片上無法形成抗原-抗體的復(fù)合結(jié)構(gòu);而當(dāng)加入含有263 ng/mL的肌紅蛋白抗原的溶液時,玻片的熒光值明顯升高,說明玻片上的肌紅蛋白抗體Myo-Ab2與標(biāo)記抗體時間分辨熒光微球-抗原的復(fù)合結(jié)構(gòu)發(fā)生反應(yīng),因此時間分辨熒光微球被成功固定于玻片上,熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。此結(jié)果表明該檢測體系是可行的。另外,還得到了在263 ng/mL,26.3 ng/mL以及2.63 ng/mL 3種不同濃度抗原下熒光的信噪比,結(jié)果如圖2b所示,隨著肌紅蛋白抗原濃度的增加,信躁比逐漸增大,表明了該免疫檢測體系對于不同濃度抗原的成功響應(yīng)。
圖2 微流控芯片方法的可行性考察實驗結(jié)果圖:(a)有無肌紅蛋白抗原存在時的熒光強(qiáng)度對比;(b)免疫檢測體系對于不同濃度肌紅蛋白抗原的響應(yīng)情況
隨后,為考察引入微流控芯片的免疫體系的檢測靈敏度,在最佳反應(yīng)條件下對一系列不同濃度的肌紅蛋白進(jìn)行檢測。如圖3b所示,當(dāng)肌紅蛋白抗原的濃度在0~100 ng/mL范圍內(nèi)時,熒光強(qiáng)度和肌紅蛋白抗原的濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2為0.9879,評估檢測下限為3.85 ng/mL,檢測靈敏度較高,該檢測方法和很多其他檢測方法相比,靈敏度相當(dāng)。
圖3 引入微流控芯片的免疫體系中不同濃度肌紅蛋白抗原對應(yīng)的熒光檢測結(jié)果:(a)熒光信躁比結(jié)果;(b)線性擬合工作曲線
綜上所述,為解決時間分辨熒光免疫層析定量檢測技術(shù)重復(fù)性差的缺陷,該研究設(shè)計并開發(fā)了一種新型免疫法,將時間分辨熒光技術(shù)與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合,對肌紅蛋白進(jìn)行高效率檢測,僅十分鐘內(nèi)便可完成檢測全過程。該檢測方法將試劑反應(yīng)、樣品分離、產(chǎn)物檢測等過程集中于一塊微小尺寸的芯片上,提高了分析過程的自動化程度。
此外由免疫色譜讀取儀檢測出的熒光信號強(qiáng)度與抗原濃度成正比,因此該方法可以作為定量分析的依據(jù),并且得出此新型免疫方法檢測肌紅蛋白的最低檢測限為3.85 ng/mL,靈敏度較高。該方法具有實驗重復(fù)性好、操作簡單、成本低廉、檢測限低、自動化程度高等特點(diǎn),適用于肌紅蛋白的臨床檢驗。
審核編輯:劉清
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原文標(biāo)題:時間分辨熒光結(jié)合微流控芯片技術(shù),用于肌紅蛋白的便捷檢測
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