人眼可以看見物體，是因為眼睛中晶狀體收集了物體發出的光線并將這些光線匯聚在視網膜上進行了成像，如太陽、電燈和螢火蟲等。對于不發光且不透明的物體，通過其表面反射光線成像，物體對不同波長的吸收不同會呈現出不同的顏色。對不發光的透明物體來說，因為與周圍介質的折射率存在差異，在兩者界面上會產生反射與折射，通過反射光或透射光與背景的差異就看到了物體。在常見的物質中，空氣的折射率約為1、水的折射率約為1.33、普通玻璃的折射率為1.5，將玻璃片置于空氣中時較容易被看到，而將其放入水中時就較難被看到了，這是由于玻璃片與水的折射率比較接近，光在兩者界面產生的反射和折射現象不是很明顯，因此不易被觀察到。若玻璃片與周圍介質的折射率更接近就沒辦法被看到了。

圖1 玻璃片在空氣和水中的情況 折射率相近導致物體不易被觀察到的情況在顯微成像中也是經常遇到的問題。顯微鏡的發明與使用對生命科學的發展具有劃時代的意義，若沒有它，人類對生物的認識只能停留在人眼可見的水平，不能深入到微觀世界，也不能對一些生命現象進行科學解釋，更不能對生命現象進行合理利用和干預。在生命科學的研究領域中，想要深入了解細胞、組織或器官內的生命活動過程就需要先對細胞的結構和組織進行深入了解，這些樣本多數為無色透明，在明場照明顯微鏡下很難清晰地觀測其微細結構。為了可以看到這些樣本的更多細節，科學家們也是煞費苦心。

染色和染料常在生物學和藥學領域被用于提高生物組織的可見度，同樣，熒光探針標記也具有類似的用途，但是兩種方式在進行顯微觀察時都需要對樣本進行預處理，這個過程繁雜且會破壞樣本的生理狀態。隨著需求的日益增加，一種簡潔且可研究細胞正常生命周期的相差顯微系統就誕生了！

相差顯微鏡最早是由荷蘭物理學家Frits Zernike提出的，它是一種可增強樣本與背景對比度的顯微成像系統（如圖2所示），在不對透明樣本進行染色處理的情況下可獲得如活細胞、微生物、薄組織切片等透明樣本的高對比度圖像。

圖2 相差顯微鏡

在介紹相差顯微鏡的工作原理前先來了解明場顯微鏡是如何工作的：當照明光通過生物標本時，由于細胞各部位細微結構的折射率和厚度的不同，樣本對光的吸收程度不同，在顯微鏡視場中就可見到明暗度不同的各物點圖像，這是由光的振幅不同所致，即相機采集到的是光強信息。但是如果樣本中需要觀察的物點近乎透明，視場中就看不出明顯的灰度差別。但是光波在通過各種物點時會發生衍射和折射，使得通過的光波因延遲而發生了偏離，其光程就有了一定的差別，即產生了所謂“相位差”。人眼不能分辨這種相位差，但可以設法將相位差轉換成振幅差。相差顯微鏡就是利用光的干涉原理，是將相位的微小變化轉換成相應振幅變化的顯微觀察裝置。

接下來介紹一下相差顯微鏡是如何將這種相位變化轉換為振幅變化的。圖3為常見的使用臨界照明方式的明場顯微成像光路，平行光束經過聚光鏡后會聚于樣本平面進行照明，樣本各區域對光的吸收程度不同，所以在顯微鏡視場中可見到明暗度不同的各物點圖像。

圖3 明場顯微成像光路

圖6為相差顯微系統的基礎光路圖，與圖3進行對比可以發現，相差顯微系統的光路就是在臨界照明的明場照明顯微系統的基礎上增加了一個環形的光闌和一個環形的相位板，這兩個器件也就是相差顯微系統的核心器件。環形光闌的作用是產生中空的環形光，不同的環狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的，透明圓環所成的像恰好落在物鏡后焦面與相板上的共軛面重合；相位板安裝在物鏡的后焦面處，相位板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位膜，它除了能推遲直射光線或衍射光的相位以外，還有吸收光使亮度發生變化的作用。

圖4 環形光闌和相位板

如圖5和圖6所示，當入射照明光通過樣本后，部分光會發生衍射偏離原來路徑（如圖5左側光線所示，圖6中綠色區域表示被物鏡收集的衍射光），但是大部分的入射光不發生衍射而是沿著原來路徑傳播（圖5中物鏡后的橙色區域），未發生衍射的光經過相位環的衰減后在相機上形成平面背景。而偏離原來路徑的衍射光在經過相位環后會發生一個90°的相移，經過相移的衍射光和未衍射光最終在相機上形成干涉圖樣，并將物體的相位信息轉化為光強信息記錄下來。

圖5 照明光照射樣本后的衍射情況

圖6 相差顯微光路

根據基礎的相差顯微系統光路以及多軸籠式結構的特點，對基礎的相差顯微光路進行修改（如圖7），然后使用多軸籠式結構的標準器件根據光路完成實驗系統的搭建（如圖8）。

圖7 系統光路

圖8 系統實物

選擇口腔上皮細胞、蛙卵單細胞和蘚精子器切片這些樣本作為實驗樣本，使用相同的放大倍率分別采集同一區域的明場圖像和相差圖像（如圖10所示）。

圖9 測試樣品

圖10 樣本的明場圖像（左）與相差圖像（右） a、b：口腔上皮細胞；c、d：蛙卵單細胞；e、f：蘚，精子器切片。

通過明場圖像與相差圖像的對比可發現，在相差顯微觀察中可以看到一些在明場顯微觀察中無法看清的細節，

注意：必須調節光闌的亮環和相位板的環狀圈重合，才能發揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂，應被吸收的光不能吸收，該延遲相位的光波不能延遲，就失去了相差顯微鏡的作用。另外，相差顯微鏡的局限在于不適合厚度大的樣品，一般以5-10μm為宜。

圖11 光闌與相位板不同位置對圖像的影響

審核編輯 ：李倩