拉曼散射是基于光子與分子中的電子云及分子鍵結(jié)的相互作用[圖1(a)]。對于自發(fā)拉曼效應(yīng)，光子將分子從基態(tài)激發(fā)到一個(gè)虛擬的能量狀態(tài)。當(dāng)激發(fā)態(tài)的分子放出一個(gè)光子后并返回到一個(gè)不同于基態(tài)的旋轉(zhuǎn)或振動(dòng)狀態(tài)。在基態(tài)與新狀態(tài)間的能量差會(huì)使得釋放光子的頻率與激發(fā)光線的波長不同。

入射的激光可以表達(dá)為：

公式 1

其中ω為分子振動(dòng)的頻率

則分子的誘導(dǎo)電偶極矩可以表達(dá)為：

公式 2

其中α為分子極化率

由于分子的振動(dòng)，原子核的位置可以表達(dá)為:

公式 3

其中ν為分子的振動(dòng)頻率

分子的極化率與分子的原子核的位置有關(guān)。可以表達(dá)為：

公式 4

因此誘導(dǎo)偶極矩可以進(jìn)一步表達(dá)為：

公式 5

把方程1帶入方程5，可以得到：

公式 6

光經(jīng)過樣本產(chǎn)生的散射與P成正比。所以從P我們就可以直接得到散射光譜的組分。

第一項(xiàng)為瑞麗散射，散射光子的頻率與入射光子的頻率相同。

第二項(xiàng)與第三項(xiàng)統(tǒng)稱為拉曼散射，散射光子的頻率與入射光子頻率不同，頻率的差等于分子的振動(dòng)頻率。其中第二項(xiàng)為斯托克斯散射，當(dāng)分子與入射光子作用時(shí)，分子處于基態(tài)，在發(fā)生拉曼散射以后，分子在入射光作用下激發(fā)到振動(dòng)激發(fā)態(tài)。因此斯托克思散射光子的頻率低于入射光子的頻率。而第三項(xiàng)對應(yīng)的是反斯托克斯拉曼散射，當(dāng)分子與入射光子作用時(shí)，分子處于振動(dòng)激發(fā)態(tài)，當(dāng)發(fā)生拉曼散射以后，分子回到基態(tài)。分子振動(dòng)的能量轉(zhuǎn)移到散射的光子上，因此，反斯托克斯光子的頻率高于入射光子的頻率。圖1(b)展示了瑞麗散射與拉曼散射的能級圖。

圖1 （a）拉曼散射與瑞麗散射 （b）拉曼散射、瑞麗散射與紅外吸收的能級圖

拉曼信號十分微弱，大概每10E7~10E8個(gè)入射的光子，只有1個(gè)光子發(fā)生拉曼散射過程[1]。因而拉曼光譜技術(shù)對于探測器的靈敏度有較高的要求。此外拉曼散射信號的強(qiáng)度是與散射光波長的四次方成反比。

#拉曼光譜的信息

由于分子內(nèi)一般會(huì)有多個(gè)分子鍵，每個(gè)分子鍵也會(huì)有多種振動(dòng)模式（伸展，擺動(dòng)，剪式運(yùn)動(dòng)等）。不同分子鍵的不同的振動(dòng)模式的振動(dòng)頻率不同，因而分子的拉曼光譜是一個(gè)多峰的光譜。圖2是老鼠骨頭的拉曼光譜[2]，可以看到分子內(nèi)不同的化學(xué)鍵可以在拉曼光譜中清楚的區(qū)分開來。

圖2 老鼠皮質(zhì)骨拉曼光譜

拉曼峰的強(qiáng)度正比于激發(fā)區(qū)域內(nèi)被激發(fā)的分子鍵個(gè)數(shù)，此外拉曼光譜的峰值與強(qiáng)度還受到環(huán)境因素的影響。因此從拉曼光譜中，我們可以得到分子的種類與濃度，樣本所受到的壓力以及樣本的相與形態(tài)等信息。

拉曼光譜圖的坐標(biāo)橫軸單位一般是波數(shù)（cm-1）,是通過1/拉曼信號波長-1/激發(fā)光波長然后將單位換算為cm-1得到的。比如785nm激發(fā)時(shí)，1010.22nm的拉曼信號對應(yīng)著2840cm-1的拉曼光譜。

#拉曼光譜的優(yōu)缺點(diǎn)

拉曼光譜的峰寬度FWHM可以窄達(dá)4cm-1（0.3nm）[3]，因而相比于光譜寬度很寬的熒光光譜（~30nm）有更好的特異性，從光譜本身就有可能得到分子組分，分子振動(dòng)的信息。拉曼光譜的窄光譜特性還使其更適合進(jìn)行多組分分析。拉曼光譜信號完全是來自于樣本分子振動(dòng)本身，不需要對樣本進(jìn)行染色等預(yù)先處理，因而適合無損的、活體的檢測實(shí)驗(yàn)。與另外一種經(jīng)常用于探測分子振動(dòng)的技術(shù)-紅外光譜技術(shù)相比，由于拉曼光譜技術(shù)的激發(fā)光一般在可見光與近紅外，因此拉曼光譜技術(shù)不像紅外光譜技術(shù)一樣容易受到水的影響，因而更適合用于溶液探測，含水的樣本探測。

不過拉曼信號十分微弱，相比于瑞麗散射弱107倍，相比于熒光蛋白的熒光信號也弱了有105-106倍。因而拉曼光譜技術(shù)對于探測器的靈敏度，信噪比有很高的要求。此外，對于生物樣本，拉曼信號常常是疊加于較強(qiáng)熒光信號之上的，為了減少熒光信號的影響，常采用785nm光進(jìn)行激發(fā)[4]，而此時(shí)拉曼信號的波長就會(huì)覆蓋到~1000nm。因而生物拉曼系統(tǒng)中，對于探測器的動(dòng)態(tài)范圍，近紅外的響應(yīng)也有較高的要求。下面表格總結(jié)了三種最常見的光譜技術(shù)：拉曼光譜，紅外光譜，熒光光譜技術(shù)的對比。

審核編輯黃宇