常見的拉曼光譜系統(tǒng)主要分為四個組成部分：

1. 激發(fā)光源（激光）

2. 樣品激發(fā)與信號收集部分

3. 波長選擇部分

4. 探測器

根據(jù)波長選擇部分的不同，拉曼光譜技術可以分為兩個類型[圖3]：1.基于色散的拉曼光譜系統(tǒng)。2.基于傅里葉變換的拉曼光譜系統(tǒng)（FT-Raman）[1]。對于前者，探測的拉曼信號通過光柵等分光器件進行分光，然后使用ccd，二極管陣列同時探測不同波長的拉曼信號。對于后者，探測器使用的是PMT，APD等點探測器，得到的原始信號是拉曼信號經(jīng)過邁克爾遜干涉儀的信號，拉曼光譜是通過對干涉信號的傅里葉變換得到的。因為FT-Raman測量光譜時間很長，需要~30分鐘。因而現(xiàn)在主流的拉曼設備是基于色散的拉曼光譜系統(tǒng)。

圖 1 拉曼光譜系統(tǒng)的分類與基本組成部分（a）色散型拉曼系統(tǒng)（b）傅里葉變換拉曼系統(tǒng)

下面將描述色散類拉曼光譜系統(tǒng)的各個組成部分的技術要求。

#激發(fā)光源

由于拉曼信號比較微弱，因此為了得到可以探測的拉曼光譜，激發(fā)光源需要使用激光器。在20年前，氬氣和氪氣離子激光器是主要使用的激發(fā)光源。近些年來，隨著半導體激光器技術的發(fā)展，一些工作波長是近紅外的半導體激光器也成為了主流。根據(jù)激發(fā)波長的不同，激發(fā)光源可以分為三個類型[1]，他們都有自己的優(yōu)缺點。

1. 紫外光源，波長是244 nm，257 nm，325 nm，364 nm

2. 可見光光源，457 nm，488 nm，514 nm， 532 nm，633 nm，660 nm

3. 近紅外光源，785 nm，830 nm，980 nm，1064 nm。

紫外光的光源通常是使用氬離子激光器。在紫外光激發(fā)的條件下，分子可以到電子激發(fā)態(tài)，從而實現(xiàn)共振拉曼激發(fā)，這可以顯著的提高拉曼的信號強度。此外，紫外激發(fā)時（＜270nm），拉曼光譜與熒光光譜在不同的波長范圍，因此紫外拉曼可以消除熒光的影響。紫外激發(fā)可以與蛋白質(zhì)，DNA，RNA等生物樣品產(chǎn)生特定性的拉曼增強，從而可以實現(xiàn)對樣本特定結構的分析，而是用可見光是無法實現(xiàn)的[2]。此外，由于紫外光在半導體的穿透深度一般是幾個納米，因而紫外拉曼可以用來對樣品表面的薄層（常見于新型硅基材料SOI材料)。

但是因為紫外光束看不見，并且紫外激光器相對更大型、更復雜，也更加昂貴，目前紫外拉曼實驗依然屬于高端技術，需要高水平專業(yè)技術人員操作。此外由于紫外光子的能量更高，在紫外激光照射下樣品更易于燒壞或者降解，生物樣本也更容易產(chǎn)生變異[3]。

可見光激光器通常為二極管激光器，532nm激光器通常為半導體激光器泵浦的固態(tài)激光器（DPSS）激光器。相比于紫外光激發(fā)的拉曼系統(tǒng)，可見光拉曼系統(tǒng)的激發(fā)光源體積小巧，價格便宜。對于鏡片、探測器等也沒有特別要求。對樣本也不容易產(chǎn)生損傷。此外，雖然相比紫外拉曼信號較弱，但是相對于近紅外激發(fā)，由于信號波長較短，所以可見光拉曼信號強度仍然較高[1]。

但是在可見光范圍，生物樣本、有機樣本會產(chǎn)生較強的熒光，因此可見光激光器通常用于測試無機物樣本。對于有機物與生物樣本，一般使用近紅外激光器激發(fā)。

近紅外激光器通常為二極管激光器，其中1064nm激光器通常為Nd:YAG激光器。相比于基于可見光的拉曼系統(tǒng)，近紅外激光器激發(fā)樣本產(chǎn)生的熒光信號會小很多[圖4][4]。此外近紅外激光的穿透深度比可見光大，因此近紅外拉曼系統(tǒng)經(jīng)常用于生物樣本與有機樣本的研究。

圖 2 不同激發(fā)光波長下熒光背景對比，波長越長，熒光背景越小

不過因為拉曼信號強度與拉曼散射的波長的四次方成反比，因而使用近紅外激發(fā)時，拉曼信號相比使用可見光與紫外光激發(fā)的時候，會弱很多。此外拉曼信號波長達到了1000nm，在這個區(qū)間，普通的ccd信噪比較低，因而需要使用特別的CCD，比如深度耗盡類CCD。

#樣品激發(fā)與信號收集部分

拉曼系統(tǒng)中，激發(fā)光一般是使用光纖傳輸或者是使用物鏡/透鏡匯聚到樣本之上，然后再使用光纖或者透鏡收集產(chǎn)生的拉曼信號，然后傳輸?shù)焦庾V儀中分光被探測器探測。具體不同的樣品激發(fā)與收集構型可以參見第四章。

#波長選擇部分

色散類拉曼系統(tǒng)，也主要分為兩種類型，一種是使用單色儀+PMT,另外一種是使用多色儀+CCD[3]。然而單色儀+PMT系統(tǒng)需要掃描光柵來探測不同波長的拉曼信號，因而探測一個完整的拉曼光譜需要較長的時間。而隨著半導體技術的發(fā)展，CCD現(xiàn)在也具有較高的靈敏度和信噪比，因此使用多色儀+CCD成為了主流的拉曼系統(tǒng)類型[圖5]。由于常見的拉曼光譜峰寬度在~20cm-1[5]，因而要求多色光譜儀分辨率至少好于10cm-1。此外拉曼光譜一般分布在500-1800cm-1，這個區(qū)域一般被稱為指紋區(qū)域，因此要求設計光柵使CCD可以探測這個區(qū)域的信號。

圖 3 基于多色儀與CCD的探測系統(tǒng)

#探測器

由于拉曼信號十分微弱，因此對于CCD的靈敏度有較高的要求，因而通常使用背照式的CCD提高量子效率。而為了能探測785nm激光激發(fā)的信號，需要探測器在1000nm附近有較好的相應，因此需要使用深度耗盡類CCD[圖6]。此外，為了降低暗噪聲的影響，通常需要對ccd進行降溫。

圖 4 不同類型CCD的量子效率曲線。背照式CCD顯著的提高了量子效率。深度耗盡類CCD提高了近紅外的響應

#拉曼信號處理方式

拉曼光譜包括了許多拉曼峰，每個拉曼峰的主要信息包括峰值的位置，寬度，強度。為了能夠從拉曼光譜中獲取更多的信息，需要對拉曼光譜進行進一步的處理。首先是先對拉曼光譜進行去除熒光，光譜儀強度響應矯正，波長標定等，得到波長，峰值均為準確的拉曼光譜。然后對于拉曼光譜可以進行以下三種處理[圖7]

圖 5 拉曼光譜的三種處理方式

1. 直接觀察拉曼光譜峰高度，光譜位置的變化，分別可以得到分子濃度，分子結構的變化。比較適合進行定性的分析，比如研究不同疾病的生物組織的組分變化[6]。

2. 首先采集含有足夠大樣本的光譜庫，然后在獲取新的樣本信號時可以進行分類算法，判斷出未知樣本屬于光譜庫里的哪個樣本。從而可以實現(xiàn)樣本識別，疾病診斷等等。常見的分類算法包括了PCA-LDA，PLS-DA等[7]。

3. 由于拉曼信號強度與分子的濃度呈正比。因此混合物的拉曼光譜可以認為是各個組分的拉曼光譜以其濃度為權重的疊加。因而使用線性分解，MCR-ALS等算法可以得到混合物中各個組分的濃度，這種方法常用于顯微拉曼系統(tǒng)中[8]。

審核編輯：湯梓紅