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基于液滴微流控的亞硫酸鹽測(cè)序平臺(tái)研究

微流控 ? 來(lái)源:EngineeringForLife ? 2023-08-17 09:11 ? 次閱讀
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全基因組DNA甲基化圖譜在整個(gè)表觀基因組圖譜中具有重要意義。單細(xì)胞DNA甲基化組學(xué)研究為根據(jù)甲基化組學(xué)特征檢測(cè)和分析細(xì)胞亞群提供強(qiáng)大助力。然而,現(xiàn)有單細(xì)胞甲基化組學(xué)技術(shù)都是基于試管或孔板,難以擴(kuò)展處理大量單細(xì)胞。

近日,來(lái)自美國(guó)弗吉尼亞理工大學(xué)(Virginia Tech)的Chang Lu教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了基于液滴微流控的亞硫酸鹽測(cè)序,用于單細(xì)胞DNA甲基化組學(xué)高通量分析的相關(guān)研究。該研究展示了一個(gè)高通量的基于液滴的單細(xì)胞亞硫酸鹽測(cè)序平臺(tái)(Drop-BS),利用液滴微流控技術(shù)提供超高通量,可在兩天內(nèi)制備多達(dá)10000個(gè)單細(xì)胞亞硫酸鹽測(cè)序文庫(kù)。將該技術(shù)應(yīng)用于混合細(xì)胞系、小鼠和人類腦組織圖譜分析,可揭示細(xì)胞類型的異質(zhì)性。Drop-BS為需要檢測(cè)大量細(xì)胞群的單細(xì)胞甲基化組學(xué)研究提供了一種有前景的解決方案。研究成果以“Droplet-based bisulfite sequencing for high-throughput profiling of single-cell DNA methylomes”為題發(fā)表在Nature Communications期刊上。

Drop-BS工作流程

Drop-BS工作流程主要涉及到五個(gè)主要步驟和三個(gè)微流控裝置。(1)scDNA封裝和破碎:使用液滴生成微流控裝置將單個(gè)細(xì)胞核和含有微球核酸酶(MNase)的裂解緩沖液封裝成液滴,用于單個(gè)細(xì)胞核裂解和基因組DNA片段化。(2)scDNA與單條形碼珠液滴配對(duì)和融合:液滴融合裝置的三個(gè)入口產(chǎn)生含有單條形碼珠和末端修復(fù)/連接試劑的液滴,兩個(gè)側(cè)入口用于scDNA液滴的再注入和間隔。(3)scDNA連接和條形碼:將融合的液滴收集到一個(gè)試管中并暴露在紫外線下。條形碼寡核苷酸因光可裂解連接體從條形碼珠中釋放出來(lái),并通過(guò)液滴中的連接反應(yīng)附加到片段gDNA上,完成scDNA條形碼編碼。條形碼完成后,液滴打破。(4)基于液滴的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化:與在試管中進(jìn)行大量轉(zhuǎn)化相比,在液滴中進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化可將文庫(kù)濃度提高9倍。使用亞硫酸鹽液滴裝置生成含有條形碼DNA和亞硫酸鹽的液滴。液滴經(jīng)孵育后進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。然后破碎液滴,匯集DNA。(5)隨機(jī)引物和indexing PCR:進(jìn)行基于隨機(jī)引物和indexing PCR的擴(kuò)增,生成用于測(cè)序的i5/i7索引文庫(kù)。

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圖1 測(cè)序文庫(kù)生成流程

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圖2 Drop-BS操作示意圖

Drop-BS性能表征

接著,研究人員進(jìn)行了物種混合實(shí)驗(yàn),以評(píng)估Drop-BS生成單細(xì)胞甲基組數(shù)據(jù)的純度。將GM12878細(xì)胞核(人細(xì)胞系)和小鼠腦細(xì)胞核以1:1比例混合,制備約1000個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞亞硫酸鹽測(cè)序文庫(kù)。經(jīng)過(guò)細(xì)胞相關(guān)條形碼的篩選,結(jié)果顯示純度大于90%,表明Drop-BS平臺(tái)有效限制了液滴間串?dāng)_,并產(chǎn)生了高純度單細(xì)胞數(shù)據(jù)集。

然后使用三種不同類型的細(xì)胞系以及這三種細(xì)胞系等量混合物制備了Drop-BS文庫(kù)。隨后,對(duì)混合細(xì)胞的甲基組數(shù)據(jù)進(jìn)行UMAP和盧萬(wàn)聚類分析,得到了三個(gè)聚類。結(jié)果顯示UMAP聚類是由于三種細(xì)胞類型的mCG水平不同,而不是由于每個(gè)細(xì)胞獨(dú)特讀數(shù)數(shù)量不同。然而,單個(gè)細(xì)胞中唯一讀數(shù)數(shù)量的不均衡造成聚類內(nèi)部的分散,當(dāng)各種細(xì)胞類型相似時(shí),可能會(huì)降低分辨率。Drop-BS數(shù)據(jù)所反映的每種細(xì)胞類型的平均全局mCG水平與之前通過(guò)批量檢測(cè)報(bào)告的值相似。聚類合并單細(xì)胞數(shù)據(jù)與單獨(dú)分析細(xì)胞系的合并單細(xì)胞數(shù)據(jù)和以前發(fā)表的細(xì)胞系甲基組學(xué)數(shù)據(jù)具有高相關(guān)性。

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圖3 利用Drop-BS識(shí)別包含三種細(xì)胞系混合樣本中的各細(xì)胞類型

利用Drop-BS進(jìn)行腦樣本分析

將Drop-BS技術(shù)用于研究小鼠和人類前額葉皮層(PFC)樣本。研究表明,小鼠和人類前額葉皮層的CG和CH甲基化水平與之前發(fā)表的數(shù)據(jù)相當(dāng),小鼠和人類PFCs的mCG/CG平均值分別為71.73%和76.12%,mCH/CH平均值分別為1.85%和2.71%,大腦樣本中的mCH含量較高,此外,TSS附近有明顯低甲基化區(qū)域,整個(gè)基因組的甲基化水平高于相鄰基因間區(qū)域。根據(jù)單細(xì)胞在全基因組100 kb箱上CH甲基化水平,進(jìn)一步對(duì)單細(xì)胞甲基組進(jìn)行盧萬(wàn)聚類分析。在小鼠PFC樣本中,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元特異性CG-DMRs是指特定細(xì)胞類型中CG甲基化水平低于其他細(xì)胞類型的區(qū)域。接著對(duì)人腦樣本進(jìn)行分析。顯示對(duì)Drop-BS大腦數(shù)據(jù)進(jìn)行UMAP聚類得到一致結(jié)果。根據(jù)合并聚類的人類神經(jīng)元特異性CG-DMRs6的CG甲基化分?jǐn)?shù),確定聚類3為抑制性神經(jīng)元,聚類1、4、5為興奮性神經(jīng)元,聚類2、6、7為非神經(jīng)元細(xì)胞。在全基因組水平和集群的各種功能元件中檢測(cè)mCH水平,發(fā)現(xiàn)全基因組水平和功能元件上都觀察到集群的mCH水平差異。

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圖4 基于腦組織中單細(xì)胞CH甲基化的Drop-BS用于區(qū)分細(xì)胞類型

綜上所述,研究人員開(kāi)發(fā)的基于液滴的單細(xì)胞亞硫酸鹽測(cè)序平臺(tái)(Drop-BS)利用液滴微流控技術(shù)優(yōu)勢(shì),其液滴生成和融合速度可達(dá)每秒數(shù)百至數(shù)千,數(shù)百萬(wàn)個(gè)液滴可在數(shù)小時(shí)內(nèi)處理完畢。這種速度在兩天內(nèi)可生成多達(dá)10000個(gè)單細(xì)胞亞硫酸鹽測(cè)序文庫(kù)。并且,基于液滴的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化率高達(dá)99.0%。此外,Drop-BS數(shù)據(jù)在細(xì)胞系(n=5741個(gè)細(xì)胞)和腦樣本(n=3936個(gè)細(xì)胞)中的平均映射效率分別為72%和63%。總之,該技術(shù)為利用組織樣本研究單細(xì)胞甲基化組學(xué)提供了一種高通量、可擴(kuò)展的方法。







審核編輯:劉清

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原文標(biāo)題:基于液滴微流控的亞硫酸鹽測(cè)序平臺(tái),用于高通量單細(xì)胞甲基化組學(xué)研究

文章出處:【微信號(hào):Micro-Fluidics,微信公眾號(hào):微流控】歡迎添加關(guān)注!文章轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明出處。

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