介紹

紐約市紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心的主要研究領(lǐng)域之一是開發(fā)納米級傳感器以在早期階段檢測癌癥。Daniel Heller 博士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組使用具有獨(dú)特光學(xué)特性的新型納米材料，可以更輕松地識別體內(nèi)疾病生物標(biāo)志物，從而可以在癥狀出現(xiàn)之前進(jìn)行檢測。這些納米技術(shù)還可以測量活細(xì)胞和組織內(nèi)的重要分子，提供加速生物醫(yī)學(xué)研究的新工具。

在光譜的近紅外 (NIR)區(qū)域工作具有多種優(yōu)勢，例如能夠避開不需要的熒光背景并更深入地探測樣品表面。在過去幾年中，采用砷化銦鎵 (InGaAs) 焦平面陣列 (FPA) 的深冷相機(jī)的出現(xiàn)提高了各種近紅外光譜和成像技術(shù)在低光科學(xué)應(yīng)用中的實(shí)用性 。

當(dāng)這種類型的科學(xué)相機(jī)與采用創(chuàng)新施密特-車爾尼特納 (SCT) 設(shè)計(jì)的新型色散光譜儀配合使用時，對研究人員會更有幫助。高精度 SCT 光譜儀大大減少了光學(xué)像差，在整個焦平面上提供具有卓越空間分辨率的清晰圖像，并使研究人員能夠利用 FPA 傳感器的完整二維來獲取圖像。

Heller 博士在紐約的研究小組已成功使用此類光色散和檢測工具進(jìn)行新穎的實(shí)驗(yàn)，研究光致發(fā)光(PL) 單壁碳納米管 (SWCNT) 的特性，這最終可能導(dǎo)致新型光學(xué)探針的開發(fā)以及用于生物物理測量和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的傳感器[4-6]。本應(yīng)用說明將介紹該小組工作的一些亮點(diǎn)以及先進(jìn) SCT 攝譜儀和深冷 InGaAs FPA 相機(jī)所發(fā)揮的不可或缺的作用。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置示例

Heller 博士的研究小組近年來對單壁碳納米管進(jìn)行了多項(xiàng) PL 光譜研究。本說明將重點(diǎn)介紹其中三項(xiàng)研究。

第一項(xiàng)研究于 2014 年報(bào)道，涉及用多種功能涂層(聚合物)封裝單壁碳納米管，這些功能涂層在碳納米管上表現(xiàn)出有序的表面覆蓋，并允許系統(tǒng)地調(diào)節(jié)納米管光學(xué)特性 。在第二項(xiàng)研究中，研究人員利用半導(dǎo)體單壁碳納米管的固有近紅外發(fā)射來光學(xué)重建碳納米管在三維體積內(nèi)的定位，從而解決了兩種不同多細(xì)胞腫瘤球體的相對滲透性[5]。最后，在第三項(xiàng)研究中，研究了單壁碳納米管發(fā)射能量對溶液離子勢的響應(yīng)，并觀察到納米管對細(xì)胞表面靜電勢的響應(yīng)由膜蛋白介導(dǎo)。

盡管每項(xiàng)單壁碳納米管研究都需要實(shí)施不同的實(shí)驗(yàn)方案，但這三項(xiàng)研究都使用了下一代普林斯頓儀器IsoPlane?-320 攝譜儀和深冷普林斯頓儀器NIRvana? InGaAs FPA 相機(jī)來執(zhí)行近紅外光致發(fā)光光譜。例如，在研究 #3 中，研究人員將 IsoPlane 和 NIRvana 集成到他們自己的定制設(shè)備中，以實(shí)現(xiàn)活體真核細(xì)胞上納米管的 PL 激發(fā)/發(fā)射光譜(見圖 1)。

圖 1：活細(xì)胞上納米管近紅外光致發(fā)光光譜的二維激發(fā)/發(fā)射裝置示意圖。圖表由紐約紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心的 Daniel Heller 博士提供。首次發(fā)表于 D. Roxbury、PV Jena、Y. Shamay、CP Horoszko 和 DA Heller，“細(xì)胞膜蛋白通過表面電荷積累調(diào)節(jié)碳納米管光學(xué)帶隙”，ACS Nano 10, 499–506 (2016)。

當(dāng)使用圖 1 所示的實(shí)驗(yàn)裝置研究 SWCNT 發(fā)射能量對溶液離子勢的響應(yīng)(研究 #3)時，使用與可變帶通濾波器耦合的超連續(xù)譜光源來激發(fā)樣品，以便將激發(fā)從 500 nm 調(diào)整到 827 nm帶寬為 20 nm。光通過 50X 物鏡注入倒置熒光顯微鏡。使用相同的物鏡收集所得的 NIR 發(fā)射并將其引導(dǎo)至 IsoPlane 攝譜儀，該攝譜儀與 NIRvana 相機(jī)耦合(熱電冷卻 InGaAs 陣列：640 x 512 像素;像素尺寸：20 x 20 μm;量子效率：>85 % 在 0.9–1.7 μm 范圍內(nèi))。

為了對研究 #3 進(jìn)行激發(fā)/發(fā)射測量，激發(fā)從 500 nm 變化到 827 nm，步長為 3 nm。在每個激發(fā)波長下，曝光時間為 0.5–3.0 秒，使用刻劃光柵(86 條槽/毫米)分散 930 至 1370 nm 的發(fā)射光。對激發(fā)功率(在樣品上測量的 5-30 mW)以及光柵和檢測器效率的波長相關(guān)變化進(jìn)行了校正。該系統(tǒng)自動用 109 個不同的激發(fā)帶照射樣品，并收集溶液中或與細(xì)胞單層接觸的碳納米管的光譜，在 0.5-5 分鐘內(nèi)生成完整的光致發(fā)光圖。

數(shù)據(jù)與結(jié)果

研究#1(聚合物涂層單壁碳納米管)：在本研究中，利用無像散 IsoPlane 攝譜儀和深冷 InGaAs 相機(jī)對聚碳二亞胺?單壁碳納米管進(jìn)行 PL 激發(fā)/發(fā)射測量。激發(fā)波長在 491 至 824 nm 之間變化，發(fā)射波長在 915 至 1354 nm 之間變化(見圖 2)。

圖 2：聚碳二亞胺?SWCNT 在 659 nm 處激發(fā)的近紅外發(fā)射光譜(上);

從聚碳二亞胺-SWCNT 和表面活性劑懸浮的 SWCNT 的光致發(fā)光激發(fā)/發(fā)射曲線中收集的納米管發(fā)射峰的中心波長。數(shù)據(jù)由紐約紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心的 Daniel Heller 博士提供。首次發(fā)表于 J. Budhathoki-Uprety、PV Jena、D. Roxbury 和 DA Heller，“碳納米管的螺旋聚碳二亞胺隱形能夠?qū)崿F(xiàn)納米管間激子能量轉(zhuǎn)移調(diào)制”，J. Am。化學(xué)。蘇克。136(44)，15545–15550(2014)。

研究人員報(bào)道了通過封裝在螺旋聚碳二亞胺中對單壁碳納米管進(jìn)行非共價(jià)官能化，形成水溶性、分散良好的聚合物-納米管復(fù)合物，具有近紅外發(fā)射功能，在環(huán)境條件下穩(wěn)定。該聚合物促進(jìn)了納米管熒光的強(qiáng)度調(diào)制，并實(shí)現(xiàn)了單獨(dú)封裝的納米管之間的納米管間激子能量轉(zhuǎn)移。這是由于封裝聚合物之間的庫侖吸引力而在納米管之間自發(fā)產(chǎn)生激子能量轉(zhuǎn)移的第一個實(shí)例，并且它表現(xiàn)出定向可逆性。這一發(fā)現(xiàn)預(yù)示著動態(tài)過程的測量以及可切換分子探針和傳感器的潛在機(jī)制。

研究#2(腫瘤滲透性)：這里，利用單壁碳納米管固有的近紅外熒光來研究多細(xì)胞腫瘤球體的滲透性。Teledyne Princeton Instruments IsoPlane 攝譜儀和 InGaAs 相機(jī)用于對表面活性劑-脫氧膽酸鈉-SWCNT 進(jìn)行激發(fā)/發(fā)射測量(見圖 3)。

圖 3：每個納米管手性標(biāo)記的光致發(fā)光激發(fā)/發(fā)射圖。用 730 nm 激發(fā)照射的樣品的發(fā)射光。數(shù)據(jù)由紐約紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心的 Daniel Heller 博士提供。首次發(fā)表于 PV Jena、Y. Shamay、J. Shah、D. Roxbury、N. Paknejad 和 DA Heller，“光致發(fā)光碳納米管詢問多細(xì)胞腫瘤球體的滲透性”，Carbon 97, 99–109 (2016)。

該研究小組報(bào)告開發(fā)了小鼠肝癌細(xì)胞的腫瘤球體模型。將這些腫瘤球體與在低粘附條件下形成球體的乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行比較。活細(xì)胞中的寬場近紅外熒光顯微鏡在空間上解析了與多細(xì)胞腫瘤球體相關(guān)的納米管的位置。研究人員發(fā)現(xiàn)，納米管在一種類型的球體(肝癌)中幾乎沒有滲透，但滲透到另一種球體(乳腺癌)的中心。因此，該小組有效地提出了使用近紅外熒光單壁碳納米管作為一種經(jīng)過驗(yàn)證的定性方法來詢問活腫瘤球體的滲透性。

研究#3(活細(xì)胞膜)：在這項(xiàng)研究中，利用攝譜儀和 InGaAs 相機(jī)對與活細(xì)胞膜相關(guān)的 SWCNT 進(jìn)行激發(fā)/發(fā)射光譜分析(見圖 4)。正如“實(shí)驗(yàn)設(shè)置示例”部分中提到的，激發(fā)波長從 500 nm 變化到 827 nm，步長為 3 nm。在每個激發(fā)波長下，曝光時間為 0.5-3.0 秒，930 至 1370 nm 的發(fā)射使用具有 86 個凹槽/毫米的刻劃光柵進(jìn)行色散。

圖 4：活 HeLa 細(xì)胞膜上納米管的光致發(fā)光二維激發(fā)/發(fā)射圖。數(shù)據(jù)由紐約紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心的 Daniel Heller 博士提供。首次發(fā)表于 D. Roxbury、PV Jena、Y. Shamay、CP Horoszko 和 DA Heller，“細(xì)胞膜蛋白通過表面電荷積累調(diào)節(jié)碳納米管光學(xué)帶隙”，ACS Nano 10, 499–506 (2016)。

研究人員發(fā)現(xiàn)，納米管光子發(fā)射能量對細(xì)胞表面蛋白介導(dǎo)的電荷積累作出反應(yīng)，并且納米管光子發(fā)射能量與細(xì)胞粘附到基質(zhì)的程度以及全細(xì)胞 zeta 電位相關(guān)。他們斷言，通過將離子電荷引入納米管的局部環(huán)境，可以在體外重現(xiàn)細(xì)胞表面的光致發(fā)光反應(yīng)。研究小組還提出了一種通過電荷密度調(diào)制納米管光致發(fā)光的機(jī)制在活細(xì)胞表面。這項(xiàng)研究表明，納米管光學(xué)帶隙調(diào)制可以通過納米管表面上的離子或聚電解質(zhì)電荷積累來介導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)預(yù)示著一種納米級工具，可用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中活細(xì)胞膜上靜電電荷積累的光學(xué)定量。

使能技術(shù)

上述研究依賴于 Teledyne Princeton Instruments 屢獲殊榮的IsoPlane-320 攝譜儀(見圖 5)。這種高精度儀器獨(dú)特的光學(xué)設(shè)計(jì)完全消除了所有波長和焦平面上所有點(diǎn)的場像散。昏迷降低到可以忽略不計(jì)的水平。光學(xué)像差的減少可顯著提高信噪比 (SNR) 和卓越的圖像質(zhì)量。IsoPlane 攝譜儀具有 320 或 160 毫米焦距和三位同軸光柵轉(zhuǎn)塔。

圖 5：Teledyne Princeton Instruments IsoPlane-320 攝譜儀

除了 IsoPlane-320 攝譜儀之外，Heller 博士的團(tuán)隊(duì)還利用 Princeton Instruments 的近紅外敏感 InGaAs FPA 相機(jī)來進(jìn)行本文重點(diǎn)介紹的研究。這款相機(jī)NIRvana:640(見圖 6)通過許多科學(xué)性能特點(diǎn)與其他 InGaAs 相機(jī)區(qū)分開來，包括深度冷卻、低暗噪聲、高線性度、低讀取噪聲、高幀速率、智能軟件和精確控制積分時間。

圖 6：Teledyne Princeton Instruments NIRvana 640 InGaAs 相機(jī)

首先也是最重要的是，可以采用免維護(hù)熱電冷卻或液氮將 NIRvana 的二維 640 x 512 InGaAs FPA 探測器分別冷卻至 -85°C 或 -190°C。專有的冷屏蔽設(shè)計(jì)和真空技術(shù)有助于盡可能降低暗噪聲，這有助于提高靈敏度并在長時間曝光時保持信噪比。

熱電冷卻 NIRvana 相機(jī)的曝光時間為 2 微秒至數(shù)分鐘，而液氮冷卻 NIRvana 相機(jī)的曝光時間范圍為 100 微秒至 1 小時。超低噪聲讀出電子器件有助于確保良好的信噪比，即使相機(jī)以其最大全幀讀出速率運(yùn)行(即，熱電冷卻 NIRvana 為 110 全幀每秒;液氮冷卻 NIRvana 為 2.77 全幀每秒)。出色的系統(tǒng)線性意味著每臺 NIRvana 相機(jī)對于科學(xué)研究來說都高度可靠。

此外，Princeton Instruments 的 64 位LightField?數(shù)據(jù)采集軟件(作為選件提供)提供了功能強(qiáng)大且易于使用的界面，使研究人員能夠輕松實(shí)現(xiàn)實(shí)時在線處理功能。NIRvana 相機(jī)可以使用可用的National Instruments LabVIEW?工具包集成到更大的實(shí)驗(yàn)中。提供全面的觸發(fā)支持以與外部設(shè)備同步。

審核編輯 黃宇