單顆粒低溫電子顯微鏡（cryo-EM）可以重建不同構象蛋白質的高分辨率結構。蛋白質的功能通常涉及瞬時功能構象，這可以通過時間分辨冷凍電子顯微鏡（TrEM）來解析。在TrEM中，蛋白質溶液在電磁柵格上快速玻璃化，經過規定的延遲時間后反應停止。盡管冷凍電鏡界對TrEM的興趣與日俱增，但制作時間分辨率低于100毫秒的TrEM樣品仍具有挑戰性。

近期，來自比利時佛朗德生物技術研究院的Rouslan G. Efremov團隊報告了一種時間分辨冷凍柱塞的設計與實現，該柱塞將基于液滴的微流控混合器與激光誘導的微射流發生器結合在一起，可快速啟動反應并冷凍電磁柵。對GroEL:GroES合子蛋白復合物進行的TrEM實驗解析了復合物形成的動力學過程，并觀察到了GroEL-ATP復合物的假定的短壽命構象。相關工作以“Time-resolved cryo-EM using a combination of droplet microfluidics with on-demand jetting”為題發表在國際頂級期刊Nature Methods上。

在微流控芯片中（圖1），兩種水溶液在油相中混合并封裝成體積約為100 pL的微液滴。液滴中的成分通過混沌平流進行混合，在液滴通過纏繞通道時，混沌平流得到加強。該研究發現，在由三圈組成的蛇形通道中，混合效率超過50%。在液滴合并產生噴霧時，混合在芯片下游完成。為了最大限度地減少噴灑在電磁柵上的油量，使用柱狀液滴合并模塊將水相液滴合并成連續流，從而將水相和油相分離到不同的通道中。混合水溶液被導入噴嘴，通過激光誘導空化（LIC）產生氣懸液滴。聚焦在噴嘴旁微流控通道上的脈沖激光被溶解在水相中的染料吸收，產生大量壽命為微秒的氣泡。氣泡的膨脹和崩潰導致半月板快速擺動和液體噴射。LIC具有局部驅動的優勢：在保持微流控芯片設計簡潔性的同時，可通過改變激光功率和頻率對過程進行調諧。該研究發現，當使用濃度高于8 mM的莧菜染料時，脈沖Q 開關Nd:YAG 激光器（WL 532 nm，6 ns）在每個脈沖和每個焦點的激光功率為4 μJ~ 10 μJ時可產生穩定的噴霧。生成液滴的速度在3至6 m/s之間。

圖1 時間分辨柱塞的設計及特性

在EM網格圖譜上觀察到的液滴數量與預期的噴射微射流數量一致（圖 2），并且隨著柱塞時間的增加而增加，因為網格在噴嘴前停留的時間更長（圖1e）。該研究對22個驟降網格的分析表明，約65%被噴霧潤濕的網格方格的冰區對電子部分透明，允許電子束穿透冰層厚度而不被完全衰減，30%被潤濕的方格的區域可用于低溫電子顯微鏡數據采集。該研究觀察到，液滴在等離子體清洗過的碳孔網表面迅速擴散，但許多孔仍然是空的。該研究認為這種效應是由于液滴在孔上擴散時產生了額外的表面能量，而使用支撐膜可以減輕這種效應。在測試了幾種支撐膜后，發現剛經過等離子體清洗的柵格上多了一層2 ~ 3納米厚的碳膜，從而改善了液滴的擴散，并將適合冷凍電鏡數據采集的孔的數量增加了2 ~ 3倍。冰的厚度小于100 nm的區域出現在柱塞時間在3到200毫秒之間的網格上。每個網格收集了幾百到幾千張高對比圖像。在每個時間點，從兩個EM網格收集低溫電子顯微鏡數據，并重建阿樸鐵蛋白和β-半乳糖苷酶的三維（3D）圖，其分辨率在2.1至3.3 ?之間。

圖2 時間分辨低溫柱塞的基準

在分辨率介于2.2和7.1 ?之間的情況下，該研究共進行了15次重建（圖3和 4），其中包括6種物質。在其中的三種復合物（GroEL-ATP、GroEL-ATP- GroES和GroEL-ATP-2GroES）中，結合核苷酸的磷酸化狀態得到了明確的解析。在其它三種復合物，即GroEL-(ADP)、GroEL-(ATP)/(ADP)和GroEL-ATP/(ADP)-GroES中，GroEL七聚環的構象與ATP和/或ADP結合的狀態相對應；然而，由于分辨率有限，結合核苷酸的磷酸化狀態不明確。所有時間點的數據質量都很高，不僅能進行高分辨率重建，還能進行三維分類，并分離出僅含4%顆粒的小群體。有趣的是，由于在50毫秒和200毫秒時，GroEL-ATP復合物所占的顆粒比例高于20秒時，因此從時間分辨數據中獲得的重建分辨率（2.7和2.3 ?）高于從連續周轉數據中獲得的分辨率（2.8 ?）。TrEM重建顯示了構象格局是如何隨著反應的進行而發生變化的（圖3）。在短反應時間（13毫秒和50毫秒）內，GroEL-ATP 復合物是主要形式，但GroEL-(ADP)和GroEL-(ATP)/(ADP)復合物也被解析出來，這些可能代表在形成GroEL-ATP構象過程中的短暫狀態。盡管這些重構的分辨率有待提高，以明確解析結合核苷酸的磷酸化狀態，但它們清楚地解析了GroEL七聚環的類ATP和類ADP構象，核苷酸結合袋含有與結合核苷酸一致的密度（圖4b）。

圖3 根據時間分辨和穩態數據對GroEL-GroES復合物進行三維重建

在該研究中，與GroEL結合的核苷酸密度在所有重構中都得到了明確的解析。更具體地說，在13毫秒時間點的GroEL-ATP狀態下，ATP分子的構象（包括一個腺嘌呤環、三個磷酸基團以及配位的Mg2?和K?）得到了很好的解析，而從50毫秒開始，該研究在分辨率介于2.3和2.8 ?之間時獲得的重構也解析了ATP結合口袋中的水分子（圖4a）。這些結果凸顯了該方法在毫秒級時間尺度上研究小分子與蛋白質相互作用的實用性。有了反應時間范圍內的構象分布，就可以分析GroEL-GroES復合物形成的動力學（圖 4c）。GroEL-GroES和GroEL-2GroES復合物的比例分別從50毫秒時的5%和0%增加到20秒時的約24%和65%。組裝始于GroEL-GroES復合物的形成，隨后加入第二個GroES七聚體。在200毫秒到20秒之間，復合物的比例出現大幅增加，這與FRET實驗估計的GroEL-GroES復合物形成的預期速率一致，即在亞秒級范圍內。該研究還通過將GroEL與ATP和GroES混合收集了13毫秒的數據，結果證實在這一較短的反應時間點，GroEL-GroES 復合物的比例較低（約為5%）。

圖4 TrEM GroEL–GroES重建的詳細信息

綜上所述，該研究介紹了一種用于制備時間分辨冷凍電鏡網格的儀器的設計、實現和驗證。它建立在皮升液滴微流控混合器和LIC按需生成可調微射流的優勢之上。這種方法解決了其他用于時間分辨冷凍電鏡的樣品制備方法的局限性，減少了樣品消耗，提高了制備的冷凍電鏡網格的可重復性，同時保持了較高的時間和空間分辨率。

審核編輯：彭菁