液滴微流控方法的出現(xiàn)極大地提高了單細(xì)胞測(cè)序的通量，然而新的問(wèn)題也在不斷地涌現(xiàn)，例如在處理復(fù)雜樣品或多樣品時(shí)，往往可能伴隨著很多干擾因素，例如細(xì)胞碎片、雜質(zhì)、空液滴等，針對(duì)這些問(wèn)題需要額外的方法進(jìn)行處理優(yōu)化，不僅影響測(cè)序工作效率，同時(shí)進(jìn)行過(guò)多的處理還會(huì)影響細(xì)胞活性，最終導(dǎo)致總體RNA捕獲效率較低。因此，現(xiàn)階段的研究方向之一就是優(yōu)化分選獲得單細(xì)胞的步驟，盡可能獲得單細(xì)胞中全部的mRNA。

近期，Sarah A. Teichmann和Florian Hollfelder團(tuán)隊(duì)在Nature Communications期刊上發(fā)表了一篇題為“spinDrop: a droplet microfluidic platform to maximise single-cell sequencing information content”的研究論文，提出了一種基于液滴微流控平臺(tái)且最大限度地提高單細(xì)胞測(cè)序信息內(nèi)容的新方法。

SpinDrop是一種可擴(kuò)展的液滴微流控方法，能以較低的成本對(duì)單個(gè)活細(xì)胞、完整細(xì)胞核、多聚甲醛固定樣本或靶細(xì)胞類型進(jìn)行高靈敏度的3’ mRNA測(cè)序。

該方案的新穎點(diǎn)有兩個(gè)方面，其一是采用熒光激活液滴分選蛋白（FADS）標(biāo)記細(xì)胞來(lái)專門(mén)分選提取目標(biāo)細(xì)胞（圖1B、1C），其二是采用多步驟加酶和微注射（Picoinjection）技術(shù)向液滴中加入了逆轉(zhuǎn)錄酶（圖1D）。

實(shí)驗(yàn)證明，與inDrop單細(xì)胞測(cè)序方法相比，該研究提出的基因檢測(cè)率提高了5倍，與10x Chromium平臺(tái)相持平，同時(shí)顯著降低了與空液滴和質(zhì)量差的細(xì)胞相關(guān)所造成的噪音。

圖1 spinDrop的模塊化液滴微流控工作流程概述

FADS法分選單個(gè)活細(xì)胞

針對(duì)采用FADS方法分選單個(gè)活細(xì)胞的可行性，該文章進(jìn)行了多個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

為證明FADS方法富集含有單個(gè)細(xì)胞液滴的能力，研究人員使用Calcein-AM染液對(duì)HEK293T細(xì)胞進(jìn)行染色，設(shè)定細(xì)胞熒光信號(hào)的閾值，通過(guò)FADS方法分選富集（只分選不裂解細(xì)胞），發(fā)現(xiàn)含有單個(gè)活細(xì)胞的液滴富集程度高達(dá)96.1%（圖2B）。

為進(jìn)一步驗(yàn)證FADS方法的潛力，研究人員將測(cè)試細(xì)胞修改為1:1比例的死和活的HEK293T細(xì)胞，對(duì)混合的死細(xì)胞和活細(xì)胞進(jìn)行分選，結(jié)果顯示，在熒光顯微鏡下，含有細(xì)胞的液滴池中，活細(xì)胞的豐度顯著提高了19倍。84.8%的液滴含有單個(gè)活細(xì)胞，超過(guò)了未經(jīng)分選的預(yù)測(cè)值4.52%。

該研究還對(duì)丟棄空液滴是否會(huì)導(dǎo)致空液滴產(chǎn)生的背景噪聲讀數(shù)比例更低（圖2D）以及測(cè)試使用FADS方法富集特定類型細(xì)胞的能力（圖2C、2E、2F）進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)論證，并取得了較為理想的結(jié)果。驗(yàn)證了FADS法分選單個(gè)活細(xì)胞可行性。

圖2 利用FADS方法分選單個(gè)活細(xì)胞可降低空液滴和死細(xì)胞的背景噪聲

多步驟加酶和微注射技術(shù)向液滴中加入逆轉(zhuǎn)錄酶

該論文指出采用熱變性和蛋白酶K方法裂解細(xì)胞可以增加RNA產(chǎn)量，但與逆轉(zhuǎn)錄酶的工作溫度不兼容，且液滴內(nèi)容物含量在封裝后不能再被調(diào)節(jié)，這就妨礙了在逆轉(zhuǎn)錄之前進(jìn)行有效的細(xì)胞裂解，因此提出通過(guò)在液滴封裝階段就加入裂解液進(jìn)行裂解，然后再通過(guò)微注射步驟將改進(jìn)的逆轉(zhuǎn)錄混合酶注射到液滴后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的方法，將裂解和逆轉(zhuǎn)錄兩步驟分開(kāi)進(jìn)行。在不影響逆轉(zhuǎn)錄的前提下，該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞更為充分的裂解，從而捕獲更多的RNA。

在用酶方面，該研究采用蛋白酶K對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解和熱變性處理可以使基因檢出率提高了三倍以上，同時(shí)使用Superscript III RT酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使得最終檢測(cè)到的基因高于其他用酶配方（圖3A）。

該研究還將spinDrop與10x Chromium和inDrop的基因檢測(cè)靈敏度進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，spinDrop檢測(cè)到的基因中位數(shù)遠(yuǎn)大于inDrop，略高于10x Chromium（圖3B）。

此外，該研究還對(duì)spinDrop方法的可重復(fù)性進(jìn)行了測(cè)試（圖3C、3D），并對(duì)spinDrop方法在微注射步驟中分隔單細(xì)胞并防止液滴合并的有效性（圖4E），以及采用spinDrop方法檢測(cè)多聚甲醛固定的細(xì)胞樣品的可行性進(jìn)行了驗(yàn)證（圖3F），以上驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)最終都取得了理想的結(jié)果。

圖3 改進(jìn)的逆轉(zhuǎn)錄混合酶和微注射混合酶后提高RNA捕獲效率

研究人員后續(xù)還對(duì)高度受損的胚胎小鼠大腦樣本進(jìn)行了分析，以驗(yàn)證spinDrop是否可以用于提高低活力生物樣品的轉(zhuǎn)錄組學(xué)質(zhì)量（圖4），并通過(guò)采用scEU-seq中的代謝標(biāo)記方法標(biāo)記新生RNA，驗(yàn)證了spinDrop平臺(tái)高通量揭示小鼠器官發(fā)生過(guò)程的可行性（圖5），從而進(jìn)一步驗(yàn)證了spinDrop在基因測(cè)序方面的優(yōu)勢(shì)。

圖4 使用spinDrop方法生成的發(fā)育階段E10.5胚胎小鼠大腦的轉(zhuǎn)錄圖譜



圖5 使用5EU-seq標(biāo)記新生RNA經(jīng)spinDrop測(cè)序后生成的小鼠器官發(fā)生過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)

總而言之，spinDrop技術(shù)建立在inDrop基礎(chǔ)上，且與之相比有很大的進(jìn)步，與常見(jiàn)的10x Chromium平臺(tái)相比也有一定優(yōu)勢(shì)，具備10x Chromium平臺(tái)所不具備的能力，例如進(jìn)行新生RNA測(cè)序和器官生發(fā)過(guò)程的揭示。基于液滴微流控的spinDrop單細(xì)胞測(cè)序法旨在從少量樣品中高靈敏度的獲取單細(xì)胞全部的RNA并建立文庫(kù)，同時(shí)將受損細(xì)胞和空液滴所造成的背景噪聲降至最低，做出更為準(zhǔn)確的結(jié)果。

審核編輯：劉清