介紹

氧分子是維持生命以及生命滅絕和材料破壞機(jī)制中最重要的分子之一。幾十年來(lái)，研究人員一直對(duì)分子氧的最低激發(fā)態(tài)單線態(tài)氧 (1O2)的物理和化學(xué)性質(zhì)很感興趣。特別是，單線態(tài)氧具有獨(dú)特的反應(yīng)性，可以導(dǎo)致聚合物降解或生物細(xì)胞死亡。它作為細(xì)胞死亡中間體的作用被癌癥光動(dòng)力療法 (PDT)所利用，該技術(shù)將光用作醫(yī)療工具。

PDT是將光敏劑(PS)摻入異常組織，然后用可見(jiàn)光照射，使其通過(guò)II型光化學(xué)途徑將能量傳遞給基態(tài)氧，產(chǎn)生單線態(tài)氧(可以通過(guò)其微弱的1270 nm直接檢測(cè)到)排放)。 由于對(duì)闡明單線態(tài)氧在亞細(xì)胞水平上的生化作用的特殊興趣，已經(jīng)提出了幾種高空間分辨率方法來(lái)使用單個(gè)光電倍增管( PMT)、線性InGaAs探測(cè)器陣列、或二維InGaAs探測(cè)器。

在本應(yīng)用說(shuō)明中，查爾斯大學(xué)(捷克共和國(guó)布拉格)的 Marek Scholz 博士對(duì)使用 Princeton Instruments 的NIRvana:640 InGaAs 相機(jī)的新型顯微光譜裝置進(jìn)行了評(píng)估。Scholz 博士報(bào)告說(shuō)，新型 NIRvana ?相機(jī)的二維 InGaAs 陣列使他本人和 Jan Hála 教授領(lǐng)導(dǎo)的光學(xué)光譜小組的其他成員能夠解決1O2磷光與NIR 擴(kuò)展的潛在光譜重疊問(wèn)題。 PS 的發(fā)光，從而首次提供了區(qū)分和分離它們的有效手段。

實(shí)驗(yàn)裝置

該實(shí)驗(yàn)裝置利用兩個(gè)檢測(cè)通道(VIS和NIR)對(duì)單線態(tài)氧和光敏劑的非常弱的近紅外磷光以及光敏劑的可見(jiàn)熒光同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)成像。這種創(chuàng)新裝置(見(jiàn)圖 1)能夠采集基于單線態(tài)氧和單個(gè)細(xì)胞光敏劑發(fā)光的光譜圖像。圖像的一個(gè)維度是空間維度，另一個(gè)維度是光譜維度，涵蓋 500 至 1700 nm 的光譜范圍。

圖 1：NIR 發(fā)光顯微光譜設(shè)置：圖的下部描繪了 VIS 和 NIR 路徑檢測(cè)到的光譜區(qū)域。

DOI：10.1039/c4pp00121d – 經(jīng)英國(guó)皇家化學(xué)學(xué)會(huì) (RSC) 代表歐洲光生物學(xué)會(huì)、歐洲化學(xué)協(xié)會(huì)和 RSC 許可復(fù)制。

如圖 1 所示，直接實(shí)時(shí)成像裝置圍繞奧林巴斯倒置熒光顯微鏡構(gòu)建，并使用 405 nm 恒定波長(zhǎng) (CW) 激光器作為激發(fā)源。激光束穿過(guò)中性密度 (ND) 濾光片，并通過(guò) 500 nm 二向色長(zhǎng)通鏡 (DLP) 耦合到近紅外校正物鏡 (OBJ)。通過(guò)在激發(fā)路徑中插入透鏡 (L1)，樣品 (S) 上的照明點(diǎn)放大至約 94 μm。為了將物鏡從樣品收集的發(fā)光發(fā)射引導(dǎo)至 NIR 路徑進(jìn)行檢測(cè)，插入了金鏡 (GM)。移除鏡子將發(fā)射引導(dǎo)至 VIS 路徑。

在 NIR 路徑中，信號(hào)通過(guò)NIR 長(zhǎng)通和短通濾波器的組合(F);過(guò)濾器的組合取決于具體的實(shí)驗(yàn)。然后，信號(hào)通過(guò)消色差透鏡(L2，f = 20 cm)聚焦到Princeton Instruments 的Acton SpectraPro ? 2500i 成像光譜儀的入口狹縫上。該光譜儀與同樣來(lái)自 Princeton Instruments 的NIRvana:640 InGaAs 相機(jī)耦合(見(jiàn)圖 2)。為了減少暗電荷，相機(jī)的近紅外敏感二維焦平面陣列 (FPA) 被冷卻至 -80°C。

圖 2：實(shí)驗(yàn)裝置的 NIR 路徑包括與 SpectraPro 2500i 成像光譜儀耦合的 Princeton Instruments NIRvana:640 二維 InGaAs 探測(cè)器。照片由查爾斯大學(xué) Marek Scholz 博士提供

2500i 光譜儀配置有用于光譜的光柵(150 g/mm，1.2 μm 閃耀)或用于成像的鏡子。為了最大限度地減少樣品光漂白，激發(fā)路徑中的快門(mén) (SH) 由 NIRvana 相機(jī)控制，并且僅在曝光時(shí)間內(nèi)打開(kāi)。在成像模式下，樣品上 0.34 x 0.34 μm 的區(qū)域被放大至 NIRvana FPA 的 20 x 20 μm 像素大小，相當(dāng)于 58 倍放大倍數(shù)。1275 nm ( 1O2磷光帶)，根據(jù)瑞利準(zhǔn)則，由衍射極限引起的空間分辨率約為 1.4 μm，由物鏡數(shù)值孔徑 0.55 確定。在光譜模式下，系統(tǒng)的光譜分辨率由光譜儀入口狹縫的寬度決定，為10 nm。

或者，在 VIS 路徑中，Princeton Instruments 的 Spec-10:400B 背照式 CCD 相機(jī)與 Acton SpectraPro 2300i 成像光譜儀耦合。最近，為了同時(shí)檢測(cè) VIS 和 NIR 光譜區(qū)域，通過(guò)用短通二向色鏡 (DM) 替換金鏡來(lái)修改設(shè)置。原來(lái)的過(guò)濾器組也進(jìn)行了修改。參見(jiàn) Scholz 等人。2014 年有關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)置的更多詳細(xì)信息。

結(jié)果與結(jié)論

光譜成像方法的引入提供了一種強(qiáng)大的新工具，用于區(qū)分和分離1O2磷光與光敏劑的近紅外擴(kuò)展發(fā)光的潛在光譜重疊。它可以應(yīng)用于任何表現(xiàn)出近紅外發(fā)光的 PS。部分?jǐn)?shù)據(jù)如下：更多內(nèi)容可參見(jiàn) Scholz 等人。2014年圖 3A 中顯示的圖像是在連續(xù)照射細(xì)胞時(shí)捕獲的，該細(xì)胞與 D2O 鹽溶液中的 100 μM TMPyP 一起孵育 5 小時(shí)，激光功率為 1 W/cm2。>1250 nm 圖像(使用 850 和 1250 nm 長(zhǎng)通濾光片的組合)是通過(guò)將一系列 10 個(gè)連續(xù)幀(每幀曝光時(shí)間為 5 秒)中的最后四幀(即總共 20 秒曝光)相加而獲得的。隨后，曝光 25 秒獲得光譜圖像。隨后拍攝明場(chǎng)和熒光圖像。光譜顯示1O2磷光是主要的光譜特征。對(duì)于不同的細(xì)胞，經(jīng)驗(yàn)證，當(dāng)使用1350 nm長(zhǎng)通濾光片代替1250 nm長(zhǎng)通濾光片時(shí)，>1250 nm圖像強(qiáng)度下降了70%以上。

圖 3：3T3 小鼠成纖維細(xì)胞與 100 μM TMPyP 在 D2 O 鹽溶液中孵育 5 小時(shí)，基于 NIR 發(fā)光的圖像和光譜，以及基于明場(chǎng)和 VIS 熒光的圖像?？蚣?A 和 B 代表兩個(gè)不同的樣本。綠色矩形由光譜儀的入口狹縫定義，代表收集光譜圖像的區(qū)域。光譜圖是通過(guò)光譜圖像的垂直合并獲得的。應(yīng)用單位半徑的高斯模糊濾波器來(lái)平滑光譜圖像，以使弱光譜特征更容易區(qū)分。

DOI：10.1039/c4pp00121d – 經(jīng)英國(guó)皇家化學(xué)學(xué)會(huì) (RSC) 代表歐洲光生物學(xué)會(huì)、歐洲光化學(xué)協(xié)會(huì)和 RSC 許可復(fù)制。

圖 3B 中顯示的圖像是使用相同程序從孵育的不同細(xì)胞中捕獲的。通過(guò)用2.5W/cm 2激光功率照射這些細(xì)胞來(lái)拍攝四張近紅外圖像。首先，使用 850 nm 長(zhǎng)通濾光片和 1100 nm 短通濾光片的組合，通過(guò) 1 秒曝光獲得850–1100 nm 圖像 (I 1 )。接下來(lái)，使用 5 秒曝光拍攝>1250 nm 圖像 (I 2 )。隨后，在添加 10 等分試樣后，獲得曝光 1 秒的“850–1100 nm + NaN 3 ”圖像 (I 3 ) 和曝光 5 秒的“>1250 nm + NaN 3 ”圖像 (I 4 )。毫米NaN 3加入樣品，輕輕攪拌，然后在黑暗中放置 5 分鐘。觀察到 850-1100 nm 信號(hào)略有下降，這可能表明存在一定程度的光漂白。然而，在 >1250 nm 圖像 (I 4 ) 中，添加 NaN 3后觀察到信號(hào)大幅下降。假設(shè)I 4圖像中的1O2信號(hào)幾乎完全猝滅，其主要由TMPyP的NIR背景發(fā)光形成。這四個(gè)圖像 I 1 –I 1的組合使研究人員能夠重建1O2發(fā)光的真實(shí)圖像。

這種新的實(shí)驗(yàn)裝置采用近紅外敏感的二維 InGaAs 焦平面陣列作為檢測(cè)器，已證明足夠靈敏，可以產(chǎn)生與 TMPyP 孵育的單個(gè)D2O處理的成纖維細(xì)胞的1O2圖像和光譜圖像。該裝置1O2磷光檢測(cè)的總體效率估計(jì)為 1–3%。主要限制因素被確定為物鏡的數(shù)值孔徑(NA = 0.55)。使能技術(shù)據(jù) Scholz 博士介紹，NIRvana:640 相機(jī)(見(jiàn)圖 4)相對(duì)于以前使用的 1D InGaAs 探測(cè)器的主要優(yōu)勢(shì)在于 NIRvana 探測(cè)陣列的二維性，這使得采集時(shí)間大幅減少，并避免了一些樣品光漂白引起的問(wèn)題。

圖 4：Princeton Instruments NIRvana:640 相機(jī)具有二維 InGaAs 檢測(cè)陣列，可熱電冷卻至 -85°C

NIRvana:640 是普林斯頓儀器公司專門(mén)為需要卓越線性度和卓越近紅外靈敏度的科學(xué)研究應(yīng)用而設(shè)計(jì)的。其 640 x 512 InGaAs 檢測(cè)陣列可提供 0.9 μm 至 1.7 μm 的響應(yīng)，可熱電冷卻至 –85°C，以最大程度地減少熱產(chǎn)生的噪聲并提高信噪比。為了量化其新顯微光譜裝置的性能參數(shù)，布拉格小組進(jìn)行了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定 NIRvana:640(-80°C)的暗噪聲。結(jié)果如圖 5 所示。

圖 5：每幀不同曝光時(shí)間的每像素暗計(jì)數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差(NIRvana640 相機(jī))。

DOI：10.1039/c4pp00121d – 經(jīng)英國(guó)皇家化學(xué)學(xué)會(huì) (RSC) 代表歐洲光生物學(xué)會(huì)、歐洲光化學(xué)協(xié)會(huì)和 RSC 許可復(fù)制。

NIRvana:640 InGaAs 相機(jī)還提供16 位數(shù)字化和低讀取噪聲，實(shí)現(xiàn)出色的動(dòng)態(tài)范圍。此外，最新的 Princeton Instruments LightField? 64 位數(shù)據(jù)采集軟件(作為選件提供)可通過(guò)極其直觀的用戶界面完全控制所有 NIRvana 硬件功能。LightField 提供自動(dòng)缺陷校正、精確曝光控制以及一系列創(chuàng)新功能，可輕松捕獲和導(dǎo)出成像和光譜數(shù)據(jù)。

概括

單線態(tài)氧是分子氧的第一激發(fā)態(tài)，是一種高活性物質(zhì)，在多種生物過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，包括細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、免疫反應(yīng)、大分子降解和光動(dòng)力治療過(guò)程中腫瘤組織的消除。

通常，采用光敏過(guò)程從基態(tài)氧產(chǎn)生單線態(tài)氧。布拉格查爾斯大學(xué)開(kāi)發(fā)和使用的創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)裝置現(xiàn)在允許研究人員對(duì)單線態(tài)氧進(jìn)行直接、實(shí)時(shí)成像，同時(shí)解決與光敏劑發(fā)出的光潛在光譜重疊的問(wèn)題。這種快速數(shù)據(jù)采集顯微光譜裝置依賴于 Princeton Instruments NIRvana:640 InGaAs 探測(cè)器的二維陣列和卓越的近紅外靈敏度。

審核編輯 黃宇