近年來，腫瘤早期診斷研究已經取得了顯著進展。其中核酸標記物在液體活檢中發揮著關鍵作用，能夠提供關于治療響應、腫瘤復發以及腫瘤內異質性等方面的重要信息。數字DNA擴增技術作為一種可靠且準確的液體活檢工具，能夠在不依賴標準參考物的情況下對微量核酸分子進行絕對定量。為了實現數字DNA擴增的單分子分辨率，需要將檢測樣本分隔到系統內的獨立區室進行擴增，并通過計數和分析陽性區室的數量和熒光強度來確定目標基因的拷貝數。

目前，數字PCR中的分區實現主要依賴于基于腔室的微流控技術和基于液滴的微流控技術。基于腔室的方法通過泵或閥門將樣本引入數萬個反應腔室的陣列中。而基于液滴的方法則通過注射泵、離心力或氣動力生成反應腔室，從而可以創建理論上無限數量的腔室，提供了更高的靈活性和更廣的動態范圍，以提高檢測能力。然而，現有的數字PCR儀往往依賴于昂貴的商業系統或專用設備，導致成本居高不下。此外，檢測過程中需要在不同設備之間進行轉換，存在交叉污染的風險，并且液滴損失可能導致目標定量低估。

因此，無論是市場還是臨床，都迫切需要一種集成化的微流控平臺，以滿足數字DNA擴增在液體活檢中的用戶需求，推動液體活檢在癌癥診療中的廣泛應用，并為個性化醫療和治療監測提供更可靠的工具。該平臺應具備獨立區室進行擴增的能力，并能夠通過計數和分析陽性區室的數量和熒光強度來確定目標基因的拷貝數。同時，該平臺應減少操作過程中交叉污染的風險和液滴損失導致的目標定量低估。此外，該平臺應具備較高的靈活性和更廣的動態范圍，以適應不同的檢測需求。

為實現上述目標，近期，香港城市大學生物醫學系、香港大學臨床腫瘤學系、晶準醫學的聯合科研團隊發表了一篇利用集成化多功能的液滴微流控技術平臺實現數字DNA擴增的研究文章，提供了一種快速高效的數字DNA擴增解決方案。相關研究內容以“An integrated and multi-functional droplet-based microfluidic platform for digital DNA amplification”為題發表在國際權威雜志Biosensors and Bioelectronic上。

高集成多功能微流控芯片的設計

首先，為了實現一個高度集成和多功能的微流控平臺，研究團隊設計了一種特殊的芯片結構，如圖1所示。該芯片結構包括連續相（油）的進口、水相（樣品）的進口、用于生成液滴的流動聚焦結構、樹狀結構分割通道，以及用于原位擴增和檢測的收集室。這種設計不僅能實現高通量的液滴生成，還能保證反應過程的一體化。

特別需要注意的是，為了克服PDMS材料的多孔性以及透氣性帶來的挑戰，研究團隊采用了三明治的芯片結構制造方法。底部玻璃載板用于支撐芯片，PDMS芯片用于液滴的生成和擴增發生以及信號檢測，并添加了硅油進行預飽和，以防止液滴的蒸發。頂部的玻璃蓋片則能夠有效防止樣品在熱循環過程中的蒸發和損失。

此外，研究團隊巧妙地設計了魯爾接頭拼接，以提供方便的樣品裝載和壓力控制，并在接頭內部設置油相儲備以提供密封保護。這種設計方法不僅有效地克服了PDMS材料多孔性導致的液滴蒸發挑戰，還確保了擴增信號的一體化檢測。同時，所采用的低成本制造方法也易于實施。

圖1 基于液滴的數字DNA擴增的全集成多功能平臺示意圖

微液滴生成及穩定性優化

液滴的大小、形狀和均一性對于高通量操作至關重要。為了提高液滴生成的通量和效率，研究團隊設計了一種樹狀結構分割通道，通過將大液滴等分為兩個較小的液滴，并通過分割角度和控制連續相和分散相的流速比，實現了對液滴尺寸的精確均一控制，使得該芯片設計在穩定性和功能性方面表現出色，能夠實現對液滴的精確控制，為后續實驗提供可靠的基礎。

為了保持液滴的穩定性，在熱循環過程中，研究團隊采取了一系列優化設計。首先，通過硅油預飽和PDMS，避免了油相在熱循環中的吸收。其次，通過對不同濃度的表面活性劑的測試優化，實現了液滴在熱循環過程中的穩定，并且對DNA擴增的性能影響較小。

綜上所述，通過改進和驗證，研究團隊實現了微流控系統中液滴生成和穩定性的提升。在擴增熱循環后，超過90%的液滴保持了其原始形狀和狀態，表明該技術平臺在液滴的穩定性方面具有良好效果。

圖2 微流控系統中液滴生成和穩定性的優化與驗證示意圖

目標分子檢測驗證

最后，研究團隊使用數字PCR（dPCR）和數字LAMP（dLAMP），針對兩種突變進行了檢測：EGFR外顯子20突變和HPV-16突變驗證了該技術平臺在DNA擴增中的可行性。EGFR外顯子20基因突變在非小細胞肺癌（NSCLC）患者中約占5% ~ 10％，而HPV感染是宮頸癌的主要原因，其中HPV-16是最常見的高危型，準確檢測對于指導治療以及改善預后至關重要。圖3結果顯示，通過數字PCR和數字LAMP，在擴增后，含有目標分子的液滴顯示出比其他液滴更高的熒光信號，表明目標分子的有效擴增。通過計算正熒光信號和負熒光信號的液滴數量，確定樣品的濃度。研究人員還使用了一定的閾值來排除擴增后由于液滴聚集而形成的大液滴。研究結果顯示，測量值與預期值之間呈現出線性、統計顯著的相關性。通過Poisson統計，測量值與預期值之間得到很好的匹配。

研究人員還將開發的平臺的結果與商業平臺的結果進行了比較，發現兩者之間存在高度一致性，這表明該平臺作為數字DNA擴增的可行替代品具有準確性和可靠性。

圖3 集成化多功能的平臺在DNA擴增中的表現示意圖

綜上所述，在這項研究中，研究團隊成功開發出一款多功能的、易于操作的基于液滴的微流控平臺，用于進行數字DNA擴增，可用于數字PCR技術平臺。該技術將液滴制備、擴增及熒光信號檢測進行了集成，從而克服了現有方法的局限性。這一改進不僅簡化了工作流程，還在微制造方面降低了成本。該平臺易于制造和操作，適用于廣泛的用戶，進一步增加了其實用性。

此平臺實現了高通量的微液滴生成，能在5分鐘內將40 μL樣品分配到超過50,000個均勻大小的微滴中（變異性< 2%）。包含目標分子的微液滴在擴增循環過程中表現出良好的穩定性，并且能夠穩定信號一段時間用于后續檢測。該平臺展示了處理多種目標和擴增方法的能力和可行性。

在對等溫和PCR的核酸定量方面，該平臺表現出了高靈敏度和準確性，顯示出巨大的潛力。該平臺有望通過幫助識別更多符合靶向治療條件的突變患者，并提供非侵入性監測方法，對個體化醫學產生重大影響，并改善患者護理。此項工作具有創新性和重要意義，為未來的研究和臨床應用奠定了堅實基礎。







審核編輯：劉清