定量相位顯微鏡(QPM)利用物波的相位信息,不僅可以提供相差圖像,還可以提供樣品三維形貌和折射率分布的定量信息。
更高的空間分辨率有利于解析樣本的更精細(xì)細(xì)節(jié)。然而,在設(shè)計(jì)顯微物鏡時(shí),通常需要在更高的空間分辨率和更小的視場(chǎng)(FOV)之間取得平衡。結(jié)構(gòu)照明顯微鏡(SIM)是一種寬視場(chǎng)、微創(chuàng)、超分辨率成像技術(shù),可以將無(wú)法分辨的高頻信息降檔為系統(tǒng)支撐區(qū)域的低頻下降,如圖1所示。
圖 1
此外,SIM還被證明具有與共聚焦顯微鏡相當(dāng)?shù)?a href="http://www.1cnz.cn/v/tag/4854/" target="_blank">光學(xué)切片能力。因此,SIM在生物醫(yī)學(xué)成像中得到了廣泛的應(yīng)用,特別是活細(xì)胞的長(zhǎng)期觀察動(dòng)力學(xué)。到目前為止,具有結(jié)構(gòu)照明的QPM已經(jīng)使用光柵或空間光調(diào)制器(SLM)實(shí)現(xiàn),并且相位成像模式通常與其他成像模式(如熒光成像)隔離開來(lái)。因此,由于同一樣本缺乏多維信息,QPM的值受到限制。
在本文中,我們提出了一種基于DMD的光學(xué)顯微鏡,它集成了多種成像模式。首先,基于結(jié)構(gòu)照明的QPM能夠在沒(méi)有熒光標(biāo)記的情況下提供樣品的定量相位圖像。其次,相干SIM提供具有分辨率增強(qiáng)的未標(biāo)記樣品的吸收/散射圖像。第三,該系統(tǒng)與熒光成像模式集成,可提供同一樣品的額外(功能/生化)信息。
系統(tǒng)原理
該系統(tǒng)的原理圖如圖2所示,使用二極管激光器作為照明源。在依次被反射鏡M1和M2反射后,激光束被耦合到光纖中并發(fā)送到裝置。在輸出端,來(lái)自光纖的光被鏡頭L1準(zhǔn)直,并由反射鏡M3引導(dǎo)至DMD(UPOLabs的HDSLM756D空間光調(diào)制器,1920×1080像素,像素大小7.56μm),入射角為24°。在DMD上,兩組具有正交方向和五相位移的條紋圖案依次加載到DMD中。DMD上顯示的條紋圖案由望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)L2-L3和L4-MO1進(jìn)一步中繼,并最終投射到放置在MO1和MO2公共焦平面上的樣品上。
在條紋照明下,然后由望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)MO2-L5將樣品成像到圖像平面。相機(jī)CCD1記錄不同成像模式的衍射圖像,qDIC中的散焦圖像和相干SIM中的聚焦圖像。同時(shí),來(lái)自樣品的發(fā)射光(熒光)將沿照明光的相反方向傳播,然后被相機(jī)CCD2收集。相機(jī)CCD1和CCD2與DMD同步,產(chǎn)生每秒15幀的采集速度,為每個(gè)通道提供亞秒級(jí)的成像速度。
圖 2
實(shí)驗(yàn)與結(jié)果
qDIC活細(xì)胞顯微鏡成像
在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中,進(jìn)行了驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),以證明在沒(méi)有熒光標(biāo)記的情況下對(duì)活樣品成像的qDIC。為此,使用活小鼠脂肪干細(xì)胞作為相樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,通過(guò)比較表明,qDIC不僅可以可視化高對(duì)比度的透明樣品,還可以為我們提供樣品光程差(OPD)的定量信息。
圖 3 小鼠脂肪干細(xì)胞的qDIC成像。
SiO2 顆粒的相干 SIM 成像
在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)對(duì)SiO2磁珠(直徑:500 nm)進(jìn)行成像,證明了使用相干結(jié)構(gòu)照明的分辨率增強(qiáng)非熒光/散射成像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示.很明顯,相干結(jié)構(gòu)照明在SiO2磁珠上提供了高分辨率圖像。
圖 4 500nm SiO2 磁珠的相干 SIM 成像。
百合花藥的雙模態(tài)(散射/熒光)成像
在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中,以百合花藥為樣本,展示了所提出的SIM裝置的雙模態(tài)(非熒光散射/熒光)成像能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示.熒光圖像經(jīng)彩色濾光片濾波后由相機(jī)CCD2捕獲,與使用均勻照明獲得的寬視場(chǎng)圖像相比,SIM圖像顯示出更詳細(xì)的結(jié)構(gòu)和更清晰的背景。此外,熒光圖像在干凈的背景中顯示了清晰的花粉結(jié)構(gòu)(具有自發(fā)熒光)。SIM圖像(透射)和熒光圖像(反射)對(duì)于同一樣品具有相反的對(duì)比度,這一點(diǎn)也很明顯。
圖 5 百合花藥的雙模態(tài)成像。
審核編輯:劉清
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原文標(biāo)題:用于定量相位和散射成像的透射結(jié)構(gòu)照明顯微鏡
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