在過去幾十年，全球經(jīng)歷了多次嚴重的病毒大流行，如2009年的豬流感病毒、2013-2016年的埃博拉病毒、2015-2016年的寨卡病毒以及2019年末開始的COVID-19病毒等。這些疫情導致了大量人員失去生命，造成重大的經(jīng)濟和社會損失。目前，可用的大多數(shù)病毒檢測方法大多靶向特定的病毒核酸和蛋白質生物標志物。然而，這些方法要么需要復雜的PCR操作，要么就是靈敏度和可靠性較差。

近期，美國加州大學（University of California）的Holger Schmidt教授，楊百翰大學（Brigham Young University）的Aaron R. Hawkins教授和得克薩斯生物醫(yī)學研究所（Texas Biomedical Research Institute）的Jean L. Patterson教授在期刊Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America上聯(lián)合發(fā)表了一篇題為“Label-free and amplification-free viral RNA quantification from primate biofluids using a trapping-assisted optofluidic nanopore platform”的工作，報告了一種集成的光流控納米孔平臺，用于對各種生物樣品液體中病毒的RNA載量進行無標記和無擴增的定量測定。

先前，該團隊報道過一種用于納米孔檢測的光流控方法，即借助捕獲區(qū)域輔助提高捕獲率的技術（trapping-assisted capture rate enhancement，TACRE），并將其應用于合成低聚物和鼻拭子樣本中的SARS-CoV-2 RNA。該方法是基于將核酸靶標固相提取到微珠上用于確保檢測的特異性，然后這些微珠被光捕獲至納米孔的電捕獲半徑內，在那里靶標可被熱釋放并快速連續(xù)地通過納米孔易位。在本工作中，該團隊報告了這一技術概念作為臨床診斷工具的驗證，對靈長類動物模型中的病毒——寨卡病毒和SARS-CoV-2進行研究。

首先，研究人員構建了如圖1所示的納米孔集成光流控平臺和實驗裝置。20 nm直徑的納米孔隙位于凸起上方的氧化膜中（T4時間點附近），Ag/AgCl電極在納米孔②和出口③之間產(chǎn)生電勢差，膜片鉗電流放大器與電極連接，以測量納米孔上的離子電流信號。與先前的TACRE工藝不同的是，本工作設計將磁珠推入凸起中，阻止磁珠暴露在流體流動中，減小磁珠上所釋放的靶標被沖走的可能性，從而進一步降低檢測的LOD。如圖所示，理論上將攜帶靶標的微珠遞送至納米孔的過程可分為四個不同的時間點（T1-T4），在此期間，微珠將受到各種力的組合作用，如Ff（流體流動力），F(xiàn)g（梯度力）和Fs（散射力，作用于光傳播的方向）。可以看到，當散射力超過流體流動力時，珠子將被推入凸起。在凸起內部，僅Fs發(fā)揮作用，這促進了磁珠被有效地光捕獲在納米孔附近。隨后，通過熱釋效應，靶分子便能迅速被納米孔檢測。

圖1 納米孔集成光流體平臺及其工作原理示意圖。

隨后，該團隊構建了基于磁珠的固相提取方法來從復雜的生物流體中（全血、尿液、精液）提取特定的病毒RNA。該固相萃取過程首先是通過基于鏈霉親和素-生物素的附著過程，將磁珠表面修飾上具有標靶特異性的下拉序列。然后，將已知數(shù)量的功能化微珠與RNA樣品混合，直到珠子上收集了所有靶標。后續(xù)，這些磁珠的一部分將會被光學捕獲在納米孔附近，其表面的靶RNA會被熱釋放進而檢測。為了定量病毒RNA的濃度，該團隊根據(jù)每個微珠上附著的病毒RNA估計數(shù)量、生物流體中RNA數(shù)量、與RNA樣品混合的珠子總數(shù)等，估算出根據(jù)TACRE方法得到的病毒RNA濃度的計算公式。

圖2 生物流體裂解和RNA提取流程示意圖。

圖3A展示了當空磁珠（無靶標）被光學捕獲并在加熱后的納米孔電流信號，結果顯示無假陽性信號。接著，該團隊以狨猴精液樣本為例進行了TACRE測定，并以PCR的結果作為獨立參考。在光學捕獲階段，4個攜帶靶標的磁珠被捕獲在納米孔附近，熱釋放后，納米孔采集到的特征易位信號如圖3B所示，最終共有2620個易位信號被觀察到。計算得到的病毒濃度，與qPCR的參考值相近。

圖3 利用寨卡病毒感染狨猴的精液樣本進行的捕獲率提高實驗結果。樣本是在接種后第 9 天采集的。

最后，該團隊將該檢測方案應用于寨卡病毒和SARS-CoV-2的綜合縱向研究，以跟蹤四周內多個生物體液樣本感染過程中的病毒載量。通過比較三種樣品的納米孔測量結果和qPCR結果發(fā)現(xiàn)，納米孔測得的值與qPCR參考值具有良好的一致性，且納米孔傳感器所獲得的病毒濃度值始終高于qPCR的結果。而這可能是因為無需逆轉錄、擴增等可能丟失靶標的操作。

圖4 利用光流控納米孔平臺進行的臨床生物流體縱向TACRE研究。

綜上所述，研究人員展示了一種集成的光流控納米孔平臺，用于臨床生物流體樣本中病毒RNA的無標記和無擴增定量檢測。采用優(yōu)化后的固相提取方法，研究人員將病毒的RNA固定于微珠表面，從而簡化并增強了目標分離的選擇性。利用光學捕獲系統(tǒng)，微珠被精準遞送到納米孔傳感器旁，并通過熱激活手段迅速釋放目標顆粒。這一過程將局部目標顆粒的濃度大幅提升至100萬倍以上，極大地加速了診斷速度，并且支持高通量檢測。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1073/pnas.2400203121