近年來，大量研究致力于開發(fā)DNA甲基化檢測方法。檢測方法的進(jìn)步可以促進(jìn)DNA甲基化在臨床醫(yī)學(xué)和科學(xué)研究方面的應(yīng)用。微流控芯片能提供反應(yīng)所需的條件和環(huán)境，可以被視作載體。微流控芯片上的分子分析由于其便攜性、高通量、低成本和高效率的優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。近年來，科研人員開發(fā)出多種新型微流控芯片用于DNA甲基化分析并顯示出明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法的優(yōu)勢。

近期，來自天津大學(xué)精密測試技術(shù)及儀器全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究人員在Nanotechnology and Precision Engineering期刊上發(fā)表題為“Advances in microfluidic-based DNA methylation analysis”的綜述性文章，討論了基于微流控技術(shù)的DNA甲基化檢測方法，并描述了近年來取得的巨大進(jìn)展。最后，研究人員總結(jié)了基于微流控技術(shù)的DNA甲基化分析方法的優(yōu)勢及其面臨的挑戰(zhàn)和前景。

DNA甲基化及其檢測

DNA分子是細(xì)胞中遺傳信息的載體分子之一，具有遺傳效應(yīng)的DNA分子被稱為基因。經(jīng)典的孟德爾遺傳定律能較好地解釋很多的遺傳學(xué)現(xiàn)象。然而，經(jīng)典的遺傳學(xué)理論并不完備，能影響生命活動(dòng)的遺傳因素眾多。隨著多年來大量研究的不斷深入，研究者們對遺傳學(xué)有了越來越豐富的認(rèn)知。

表觀遺傳學(xué)是遺傳學(xué)的一個(gè)分支，主要研究在原始DNA序列沒有改變的情況下發(fā)生的基因表達(dá)可遺傳的變異。大量的研究表明，表觀遺傳與發(fā)育、衰老、疾病等生命過程相關(guān)。共價(jià)組蛋白修飾和DNA甲基化是表觀遺傳現(xiàn)象中被關(guān)注最多的分支。表觀遺傳修飾對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)、DNA和蛋白質(zhì)相互作用、X染色體沉默和基因組印跡等方面均有著影響。

DNA甲基化作為表觀遺傳的現(xiàn)象之一，影響著遺傳物質(zhì)的表達(dá)。在真核細(xì)胞中，其一般發(fā)生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上。CpG二核苷酸在蛋白質(zhì)編碼基因的啟動(dòng)子和第一外顯子中的分布相對廣泛，說明這種分布并非隨機(jī)。CpG二核苷酸含量相對較高的區(qū)域稱為CpG島：大多數(shù)的蛋白質(zhì)編碼基因在啟動(dòng)子區(qū)域含有CpG島，且其甲基化程度通常與基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)。DNA甲基化在不同細(xì)胞、組織或個(gè)體間有著一定程度的差異。圖1展示了一種基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，涉及多種相互作用。DNMT蛋白可以主動(dòng)改變DNA的甲基化狀態(tài)，Tet蛋白也被發(fā)現(xiàn)對DNA甲基化具有調(diào)節(jié)作用。甲基化CpG可以通過甲基CpG結(jié)合域（MBD）蛋白來確定。結(jié)合后，組蛋白脫乙酰酶（HDAC）可以修飾到組蛋白尾部，從而去除乙酰化（AC）。在上述過程之后，染色質(zhì)被壓縮并且基因表達(dá)被抑制。甲基化修飾在染色質(zhì)狀態(tài)的調(diào)節(jié)中起著重要作用。



圖1 DNA甲基化對基因表達(dá)的影響

DNA甲基化（如抑癌基因啟動(dòng)子CpG島的高甲基化）被發(fā)現(xiàn)與癌癥有很強(qiáng)的關(guān)系。許多的DNA甲基化的變化被證明與某種癌癥的發(fā)生有著特異性的關(guān)聯(lián)，并且在早期就能被檢測到。一些研究證明了伴隨癌癥發(fā)生的基因組整體甲基化程度降低。而且不同種類的癌癥有著各自特異性的甲基化修飾特征。該綜述也提到了能同時(shí)篩查多種癌癥的研究工作。因而胞嘧啶的甲基化修飾擁有著被用作癌癥篩查或診療的標(biāo)志物的極大的潛力。

一方面，由于缺乏大規(guī)模的驗(yàn)證和比較，DNA甲基化作為臨床醫(yī)學(xué)中疾病診療的依據(jù)仍然受到限制。另一方面，DNA甲基化在空間上的和時(shí)間上的異質(zhì)性對檢測手段提出了很高的要求。雖然已經(jīng)開發(fā)出了不同的檢測方法，但是現(xiàn)有的方法仍然存在不足，這很大程度上限制了甲基化檢測被應(yīng)用于臨床醫(yī)療。因此，近些年來大量的研究聚焦在DNA甲基化的檢測方法上。

已經(jīng)開發(fā)出多種極具潛力的方法來檢測甲基胞嘧啶，以滿足不同情況下的檢測要求，圖2列出了一個(gè)較為典型的DNA甲基化檢測流程。這些方法在靈敏度、成本、定量能力、分辨率、掃描范圍和響應(yīng)時(shí)間方面差異很大。而且，受制于工作流程的復(fù)雜性以及已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與癌癥的特定關(guān)系不足等因素，DNA甲基化在臨床上的應(yīng)用并沒有達(dá)到預(yù)期。因此，DNA甲基化檢測手段是一個(gè)關(guān)鍵因素。很多的研究聚焦在開發(fā)更為簡便高效、低成本、高通量、高靈敏度的檢測方法上。

圖2 典型DNA甲基化分析的工作流程

基于微流控芯片的檢測方法

DNA甲基化分析在臨床醫(yī)學(xué)和科學(xué)研究中的應(yīng)用沒有達(dá)到最初的預(yù)期，部分原因是分析方法的復(fù)雜性、成本、通量和效率。為了促進(jìn)對DNA甲基化的理解，研究人員做出了多方面的努力。已經(jīng)開發(fā)并報(bào)道了新的方法，近年來，基于微流控技術(shù)的分析優(yōu)勢逐漸凸顯。微流控芯片方法被認(rèn)為是有前景的，有望促進(jìn)DNA甲基化分析的更多應(yīng)用。目前已有的方法主要集中在樣本前處理微流控芯片、產(chǎn)物檢測微流控芯片、片上實(shí)驗(yàn)室等幾個(gè)方面。微流控芯片可以被開發(fā)用于樣本亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化、核酸提取、目標(biāo)細(xì)胞篩選富集。另外，在產(chǎn)物檢測方面，微流控芯片可以結(jié)合電泳、表面等離子體共振、特異性擴(kuò)增、數(shù)字式擴(kuò)增、免疫分析等檢測方法，可以實(shí)現(xiàn)高通量且低成本的檢測。一種在微流控芯片上進(jìn)行的數(shù)字式擴(kuò)增和檢測用于DNA甲基化分析的方法被認(rèn)為是極具應(yīng)用潛力的。研究人員已經(jīng)設(shè)計(jì)、制造并驗(yàn)證了微陣列芯片，以并行地對每個(gè)目標(biāo)分子進(jìn)行分析。含有不同甲基化DNA的樣品用亞硫酸氫鹽試劑處理并純化。制備后，將PCR混合物驅(qū)動(dòng)到微腔中，并通過油分散以產(chǎn)生均勻的反應(yīng)，從而可以數(shù)字詢問甲基化狀態(tài)。根據(jù)高分辨率熔體（HRM）分析的原理，超甲基化模板在轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增后將表現(xiàn)出更高的熔融溫度。甲基化狀態(tài)是通過詢問熔化溫度來判斷的。超低檢測限已在該平臺(tái)上得到確認(rèn)，這說明了基于數(shù)字熔化的DNA甲基化分析的優(yōu)勢。

通過微流控技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高度集成的檢測。芯片實(shí)驗(yàn)室或微全分析系統(tǒng)具有多種優(yōu)點(diǎn)。可以在芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)上以快速簡單的方式進(jìn)行各種臨床或生化臨床測試。在芯片上進(jìn)行DNA甲基化分析的整個(gè)過程是一個(gè)非常有吸引力的前景。已經(jīng)有很多相關(guān)研究致力于開發(fā)用于檢測DNA甲基化的微流控芯片。

基于微流控芯片實(shí)現(xiàn)樣本前處理

亞硫酸氫鹽可用于將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不會(huì)受到影響。經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理的甲基化胞嘧啶和非甲基化胞胞嘧啶在PCR擴(kuò)增或測序中表現(xiàn)不同。胞嘧啶的甲基化修飾可以通過對比亞硫酸氫鹽處理前后的序列來確定。然而，基于亞硫酸氫鹽的分析的局限性之一是亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的復(fù)雜性。此外，在處理過程中，樣品反復(fù)暴露在環(huán)境中并在容器之間轉(zhuǎn)移，這可能導(dǎo)致污染和樣品損失。亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過程中引入的污染和樣品損失可能導(dǎo)致假陽性（陰性）、有偏差的定量或擴(kuò)增抑制。為了解決這個(gè)問題，微流控芯片可以作為亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的優(yōu)良載體。

MBD蛋白可以修飾到表面上以捕獲目標(biāo)分子，這很容易通過微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)。另外還可以從細(xì)胞篩選的角度促進(jìn)DNA甲基化分析。靶細(xì)胞的選擇和分離可以通過親和富集來實(shí)現(xiàn)，可用于下游甲基化分析。當(dāng)流體流過芯片時(shí)，目標(biāo)細(xì)胞被捕獲，從而實(shí)現(xiàn)富集。目標(biāo)細(xì)胞可以被圖案化在器件上的微結(jié)構(gòu)捕獲，因?yàn)樗鼈兣c其他細(xì)胞具有不同的尺寸。該研究豐富了微流控技術(shù)在DNA甲基化分析中的應(yīng)用，該設(shè)備與多個(gè)下游分析相匹配。需要進(jìn)一步探索其與不同分析方法的耦合。

基于微流控芯片實(shí)現(xiàn)數(shù)字式檢測

大多數(shù)方法的定量能力不足，也缺乏檢測稀有DNA甲基化修飾的能力。異常的DNA甲基化是癌變組織中常見的表觀遺傳改變。然而，異常甲基化在正常組織中也可能較少出現(xiàn)，這有可能被用作癌癥風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物。局限性在于正常組織中稀有甲基化的檢測和精確定量可能超過傳統(tǒng)的定量PCR的能力。數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）技術(shù)在1999年被Vogelstein和Kinzler提出，被認(rèn)為是第三代PCR技術(shù)。對于上述問題，基于數(shù)字PCR的DNA甲基化檢測得到了極具競爭力的結(jié)果，而絕大多數(shù)的數(shù)字PCR方法都是基于微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。DNA甲基化檢測被進(jìn)一步地開發(fā)出了數(shù)字化的形式。稀有的甲基化等位基因可以被成功檢測到并實(shí)現(xiàn)絕對定量。這種方法的意義在于它擁有檢測到正常組織中的稀有的甲基化修飾的能力。如圖3所示，微流控芯片可以以不同的方法幫助形成大量相互獨(dú)立且穩(wěn)定的液滴，包括大量微腔、油水相互作用等方法，這是微流控芯片的優(yōu)勢所在。



圖3 基于數(shù)字熔解分析的DNA甲基化分析

基于微流控芯片實(shí)現(xiàn)“樣本進(jìn)-結(jié)果出”檢測

研究人員致力于開發(fā)高度集成的檢測方法，微流控技術(shù)提供了一條途徑。具有多方面優(yōu)勢的芯片實(shí)驗(yàn)室或微全分析系統(tǒng)的檢測模式可以以快速和簡單的方式在芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)上進(jìn)行各種臨床或生化臨床測試。如圖4所示，這種檢測模式可以允許包括樣本預(yù)處理在內(nèi)的所有的檢測步驟都在芯片上執(zhí)行，無需過多的人為操作和干預(yù)。在芯片上進(jìn)行DNA甲基化分析的整個(gè)過程具有重要意義。盡管芯片可以實(shí)現(xiàn)“樣本輸入-結(jié)果輸出”檢測，但目前已有的方法只能實(shí)現(xiàn)單次處理一個(gè)樣本。

圖4 “樣本進(jìn)-結(jié)果出”DNA甲基化檢測微流控芯片

微流控芯片的優(yōu)勢

本文介紹并討論了基于微流控的DNA甲基化分析的最新進(jìn)展。近年來，DNA甲基化引起了人們越來越多的關(guān)注，微流控技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于DNA甲基化的一些研究中。許多傳統(tǒng)方法已經(jīng)在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)。比較目前已報(bào)道的多種基于微流控芯片的DNA甲基化檢測可以發(fā)現(xiàn)一些值得關(guān)注的特點(diǎn)。微流控芯片作為DNA甲基化檢測的很好的載體，能較好地減少外部干擾，防止污染等因素對檢測結(jié)果造成影響。盡管基于數(shù)字PCR的DNA甲基化分析的復(fù)雜性較為明顯，但其高靈敏度是不可否認(rèn)的，因此嘗試開發(fā)更為簡便高效的方法是有意義的。不同微流控器件之間的差異性較大，具體表現(xiàn)在靈敏度、定量能力、成本、檢測限、響應(yīng)時(shí)間等方面，而且在用途上也表現(xiàn)出了多樣性，如用于樣本前處理的微流控器件、基于不同檢測原理的微流控器件、用于芯片實(shí)驗(yàn)室的微流控器件等。

圖5 DNA甲基化檢測方法

可以通過使用基于微流控的方法而不是傳統(tǒng)的方法來減少分析所需的時(shí)間。多項(xiàng)研究利用微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)了DNA甲基化的快速分析。其次，通過創(chuàng)建具有用于dPCR擴(kuò)增的多個(gè)腔室的微流控芯片，可以以非常高的精度和靈敏度來量化DNA甲基化異質(zhì)性。開發(fā)了基于dPCR的多重DNA甲基化分析方法。第三，一些研究通過使用微流控芯片實(shí)現(xiàn)了靈敏的DNA甲基化分析，檢測極限極低。微流控技術(shù)使單細(xì)胞DNA甲基化分析成為可能。最后，在微流控芯片上可以實(shí)現(xiàn)DNA的高效富集。總之，微流控技術(shù)為傳統(tǒng)的DNA甲基化分析帶來了多方面的改進(jìn)。在未來，還有一些方面可以進(jìn)一步探索。首先，應(yīng)開發(fā)具有多功能的微流控系統(tǒng)，以應(yīng)對不同的臨床情況和需求。其次，預(yù)計(jì)將在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)更多種類的傳統(tǒng)技術(shù)，這可能產(chǎn)生與當(dāng)前方法相比具有競爭力的結(jié)果。關(guān)鍵的芯片上步驟，包括但不限于基因組DNA提取、亞硫酸氫鹽處理、擴(kuò)增和檢測，需要優(yōu)化以提高基于微流控的方法的競爭力。最后，開發(fā)高集成度和高通量的微流控方法仍有待進(jìn)一步探索。在臨床診斷和治療領(lǐng)域，肯定需要改進(jìn)DNA甲基化分析方法。微流控技術(shù)提供了一種很有前途的方法，可以以靈敏、便攜、快速、低成本和高通量的方式進(jìn)行DNA甲基化分析。

論文鏈接： https://doi.org/10.1063/10.0023845



審核編輯：劉清