糖作為生命體系中三大聚合物分子之一，具有遠超核酸和蛋白的復雜結(jié)構(gòu)。實現(xiàn)高效的糖結(jié)構(gòu)鑒定和序列解析是開展糖類物質(zhì)活性與功能研究的基礎(chǔ)，是推動糖科學快速發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。前期工作中，中國科學院上海藥物研究所研究員高召兵聯(lián)合攻關(guān)團隊利用基因工程改造后的生物納米孔描繪了糖官能團的電信號指紋圖譜，將納米孔在糖領(lǐng)域的研究從“糖檢測”推進至“糖測序”階段，納米孔糖測序已成為研究熱點。糖的結(jié)構(gòu)復雜，具備對復雜聚糖的綜合傳感能力是實現(xiàn)納米孔糖測序需要解決的前提之一，然而已有納米孔均不具備區(qū)分復雜聚糖的能力。

近日，高召兵與上海藥物所副研究員夏冰清，研究員文留青、程曦等，在前期工作基礎(chǔ)上設(shè)計并構(gòu)建了新型工程化生物納米孔。利用該納米孔，團隊取得了糖測序研發(fā)進程中的多項進展，實現(xiàn)了鏈長達到十糖的復雜聚糖電信號解析，并達到了單糖分辨率，同時實現(xiàn)復雜聚糖分子異構(gòu)體的區(qū)分。該工作是生物納米孔糖測序技術(shù)研發(fā)進程中的節(jié)點性工作。相關(guān)成果以“Direct Identification of Complex Glycans via a Highly Sensitive Engineered Nanopore”為題發(fā)表在《美國化學會志》上，并被選為封面文章。研究工作得到國家杰出青年科學基金、上海市自然科學基金等的支持。

為進一步優(yōu)化突變納米孔α -溶血素（M113R）的檢測靈敏度以及檢測窗口，該團隊基于前期的工作對M113R進行新一輪基因工程改造。在保留一級傳感位點M113R的基礎(chǔ)上，對多個二級位點進行了丙氨酸突變，這有利于在維持信號響應的同時增大對糖分子鏈長或體積的檢測限。研究篩選獲得了在大尺寸復雜聚糖傳感中表現(xiàn)出較大潛力的工程化納米孔α -溶血素（M113R/T115A）。利用該突變納米孔，研究人員獲得了只存在單糖差異的聚糖電信號，表征了聚糖中的單糖結(jié)構(gòu)差異，說明M113R/T115A納米孔對糖分子結(jié)構(gòu)具備單糖分辨率。研究團隊利用M113R/T115A實現(xiàn)了從五糖到十糖的連續(xù)檢測，對其實現(xiàn)了顯著區(qū)分，納米孔對于寡糖的實際讀長達到10，為實現(xiàn)糖測序打下了基礎(chǔ)。研究利用該納米孔檢測了具有不同糖苷鍵的寡糖異構(gòu)體，實現(xiàn)了不同鏈長異構(gòu)體的區(qū)分，區(qū)分度達0.9，說明該納米孔可同時區(qū)分多種寡糖的結(jié)構(gòu)差異。進一步通過剖析納米孔-糖互作模式，研究人員闡明了納米孔高靈敏度鑒定復雜聚糖微小差異的分子機制。該團隊提供了實現(xiàn)復雜聚糖鏈長和結(jié)構(gòu)區(qū)分的納米孔設(shè)計范式，其單糖分辨率、鏈長讀取能力、異構(gòu)差異區(qū)分等為最終攻克納米孔糖測序發(fā)展過程中多個無法規(guī)避的難點提供了借鑒。



納米孔M113R/T115A區(qū)分復雜聚糖原理示意圖

綜上所述，聚糖的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性包括種類豐富的單糖構(gòu)建模塊、多種形式的糖苷鍵、長短不一的鏈長和分支等，這給聚糖分析帶來了挑戰(zhàn)。該研究設(shè)計的工程化納米孔提供了無適配體、高分辨率的方法，實現(xiàn)了對聚糖結(jié)構(gòu)的多方位區(qū)分，并在大尺寸、多官能團、極微差異的復雜聚糖區(qū)分方面取得進展。

論文鏈接： https://doi.org/10.1021/jacs.4c02081

審核編輯：劉清