圖 小鼠前額葉皮層中葡聚糖(綠色)和 tdTomato (紅色)標(biāo)記的中間神經(jīng)元的三光子成像，深度約為 1 mm(數(shù)據(jù)由 Timo van Kerkoerle 博士和 Marie Guillemant 提供，Neurospin，CEA Saclay)

熒光蛋白和探針的三光子(3P)激發(fā)目前引起了人們的極大興趣，尤其是在神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域。正如 Chris Xu 和其他研究人員所證實(shí)的那樣，一個重要原因是用于三光子激發(fā)的1300 nm 和1700 nm 波長窗口帶來更深的穿透深度。

三光子激發(fā)還可以提供比雙光子激發(fā)更高的信噪比，并且?guī)缀鯖]有離焦熒光。這就可以穿透> 1 mm 厚的大腦皮層，在活體小鼠大腦中進(jìn)行更深的成像。

同樣重要的是，1300 nm 波長符合綠色熒光蛋白和探針(如葡聚糖)的三光子激發(fā)能量要求，而 1700 nm 可用于激發(fā)更長波靶向，如 tdTomato。

一些研究人員希望同時激發(fā)多個探針以對哺乳動物大腦進(jìn)行更復(fù)雜的探究。這種信息豐富的數(shù)據(jù)可以加速研究人員了解神經(jīng)連接和活動與重要功能之間關(guān)系的進(jìn)程。

使用兩種激發(fā)波長可以同時對短波和長波探針進(jìn)行成像。但是，這有一些限制。首先，產(chǎn)生兩種波長的光束在顯微鏡中合并。它們會很復(fù)雜(而且成本更高)。然后是功率負(fù)荷問題;使用兩個激光源來激發(fā)活體組織意味著要在樣品上使用兩倍的激光功率。此外，直到最近，還沒有針對 1300 nm 或 1700 nm 的簡單(即“一體化”)光源，因此研究人員通常會使用 1040 nm 左右的激光來泵浦可調(diào)諧 OPA 產(chǎn)生 1300 nm 或 1700 nm。

但是兩種發(fā)展的結(jié)合使得短波長和長波長探針的三光子激發(fā)變得更加簡單，從而可以被更廣泛的用戶所接受。

1300 nm 激發(fā)長波探針

最近的幾項三光子成像研究表明，1300 nm 可用于激發(fā)綠色和紅色熒光探針。然后使用過濾器在兩個相機(jī)中分別檢測來自兩個探針的光。例如Timo van Kerkoerle 和他的博士生 Marie Guillemant 使用 Monaco 和 Opera-F 產(chǎn)生 1300 nm 激光，演示了通過三光子激發(fā)在小鼠前額葉皮層中同時激發(fā)葡聚糖和 tdTomato 標(biāo)記的中間神經(jīng)元(如圖)。此處的 z 堆棧圖像顯示，紅移探針激發(fā)信號甚至在深度約為 1 mm 時也很顯著。

許多常用的紅色熒光分子成像以前通常使用 1700 nm 激發(fā)到最低能態(tài)，這項工作表明這些常用的紅色熒光分子也可以在 1300 nm 激發(fā)到更高能量電子態(tài)。這種新的激發(fā)機(jī)制允許僅使用 1300 nm 激光在小鼠大腦中進(jìn)行雙重綠色和紅色三光子熒光成像。

我們相信 Timo van Kerkoerle 和 Chris Xu 的這些發(fā)現(xiàn)顯然會對成像和功能性熒光探針的三光子激發(fā)的未來發(fā)展方向產(chǎn)生影響。

一體化 1300 nm 脈沖光源

新近推出的Coherent Monaco 1300 一體化激光器，為三光子激發(fā)提供了 1300 nm 飛秒光源。由于三光子圖像亮度與激光峰值功率的三次方成正比，這款激光器的短脈沖寬度和高峰值功率的特點(diǎn)，非常適合三光子成像。

高達(dá) 2.5 W 的功率輸出，可選擇 1、2 或 4 MHz 重復(fù)頻率，支持快速圖像采集。

高質(zhì)量(M2<1.3 )，在三維空間上提高顯微鏡的成像數(shù)量、成像效率和圖像分辨率。

一體化結(jié)構(gòu)還包括兩個常用功能選項，從而簡化三光子成像并提高圖像亮度。包括提供動態(tài)功率衰減/門控的全功率控制(TPC)功能;提供色散預(yù)補(bǔ)償以在樣品處獲得理想脈沖寬度的緊湊型脈沖壓縮器(CPC)。

三光子成像的美好未來

使用單個激光源激發(fā)多個探針有望推動神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，該技術(shù)基于跨皮層深層映射多種細(xì)胞類型，實(shí)現(xiàn)對大腦容量的快速、信息豐富的成像。三光子激發(fā)技術(shù)和相關(guān)機(jī)制的發(fā)展無疑有助于為正在決定選擇可調(diào)諧還是單波長三光子激發(fā)光源的研究人員提供指引，并突出(如 Coherent Monaco 1300 )解決方案的價值。

審核編輯 黃宇