長久以來，在復雜、異質的樣品中同時識別以及定位多個分子或者分子組裝的能力一直是推動熒光顯微鏡在生物和物理科學研究中應用的主要特性。例如，自1986年以來，使用四種光譜上的不同熒光團來識別DNA中的腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和鳥嘌呤（G）堿基，這一直是大多數自動化DNA測序技術的基礎。然而，對大規模生物系統的基因組和轉錄組的研究可能需要同時識別和定位成百上千的分子標靶。這種高度并行的分析超出了基于光譜鑒別的多路復用能力。Lumencor分析了基于光譜鑒別的多路復用熒光檢測的局限性，以及為擴大可檢測標靶數量而引入的一些固態光源新技術。

光譜鑒別的局限性

大多數多路復用檢測方案都基于光譜鑒別，因為與基于時間或空間鑒別方法相比，它的技術復雜性較低，成本也較低。然而由于光譜串擾，光譜的鑒別方法范圍僅限于大約5個目標（圖1和圖2）。這種局限性主要是由于用于雙分子標記的熒光染料和熒光蛋白（FP）的光譜特性，如圖1 所示。在此示例中，雖然只有兩個熒光標記，但它們的激發和發射波長跨越了整個可見光波長范圍（400-700nm），并且具有明顯的光譜重疊，會導致光譜分離不完全。如果以485nm左右的光進行激發（灰色部分），兩種熒光團會被同時激發。只有波長大于550nm時才能選擇性地激發其中的一種，從而獲得光譜鑒別。

圖1. Alexa Flour488和Alexa Fluor 555熒光染料的歸一化熒光激發和發射光譜。發射光譜的重疊區域由綠色陰影表示。灰色陰影區域表示圖2中用于采集圖像A-C的激發帶寬（475/28nm）。

針對串擾的問題，雖然已經開發出具有窄發射光譜的量子點納米晶體，可以提供更好的分離光譜。但與有機染料相比，這種改進的代價是熒光團尺寸增加了一個數量級以上，這反過來又阻礙了它們在雙分子標記應用中的應用。

Lumencor的固態光引擎優化了輸出光譜，提供了多個窄線寬的光源，盡可能實現對特定熒光染料的精確激發，而這對于多重熒光檢測至關重要，可以有效減小光譜串擾問題的發生。下圖中是使用Lumencor SPECTRA光引擎、Andor Zyla 5.5 sCMOS相機和Nikon Ti2顯微鏡對麂皮成纖維細胞進行成像。可以看到由于激發光帶寬（555/28 nm）與Alexa Fluor 488的激發光譜沒有顯著交叉，因此圖像沒有因串擾而退化。

圖2. 四張60倍熒光圖像，展示了同一視野下的麂皮成纖維細胞。

用Alexa Fluor 488 phalloidin (actin)以及mouse anti–OxPhos Complex V + Alexa Fluor 555 goat anti–mouse IgG (mitochondria)進行標記。A.使用單波段激光和發散濾光片以及單波段的二色分光鏡來獲得的肌動蛋白細胞骨架的圖像。B.使用單波段激發和發射濾光片以及多波段段二色分光鏡來獲得的等效肌動蛋白細胞骨架圖像。C.由于光譜串擾導致線粒體檢測時肌動蛋白細胞骨架圖像退化。圖像使用單波段激發濾光片、多波段二色分光鏡和多波段的發射濾光片獲得。D.使用單波段激發濾光片、多波段二色分光鏡和多波段發射濾光片獲得的線粒體圖像。

多重熒光成像的突破

好馬配好鞍，為了充分利用 Lumencor 光源的優秀性能，科研人員正在進一步開發和優化用于多路復用熒光檢測的方案。

優化的光學濾光片和解混算法

來自美國國家神經系統疾病和卒中研究所的一篇Nature論文中有為解決多重熒光成像的熒光串擾問題提供了一些新策略。為了理解大腦中健康和病理生理過沖需要對多個組織樣本進行大量的組織學觀察，以表征所有主要的腦細胞類型。為了實現大規模多重免疫熒光成像技術，以實現多達10種不同熒光標記物的同時成像，從硬件上，他們優化了濾光片的組合，使用了10組自定義的激發/二向色/發射濾光片組合，這些精心挑選的濾光片被優化用于迭代成像不同的光譜兼容的熒光標記物，以確保在成像光譜范圍內具有最小的光譜串擾。而從軟件上，本文中也開發了多種算法以從復雜的腦組織樣本中提取出豐富和準確的生物學信息，主要是一種半監督稀疏線性光譜解混算法，校正原始熒光圖像數據的串擾和非特異性標記，提高了信號分離的準確性。

Lumencor固態光引擎SPECTRA的光譜輸出針對本方案中使用的熒光染料面板的選擇性激發進行了優化，如圖3所示。光引擎集成了 LED、光管和激光器，以實現所需的光譜激發分布和所需的光功率。使用相同的熒光染料組合和濾光片配置，通過連續的剝離、重新標記和成像輪次，可以增加多重檢測的程度。通過5個周期的剝離、10倍多重標記和成像，已證明可以在大鼠大腦冠狀切片中同時定位50個生物標記靶標。

圖3. SPECTRA光引擎的光譜輸出經過優化，可選擇性激發用于10倍免疫熒光檢測的熒光染料。

參考文獻：

D Maric, J Jahanipour, B Roysam et al., Whole-brain tissue mapping toolkit using large-scale highly multiplexed immunofluorescence imaging and deep neural networks. Nature Communications (2021)12:1550

MERFISH技術

通過在基于光譜鑒別的多路復用技術中添加空間和時間維度，已經開發出能夠同時識別和定位數百和數千個生物分子標靶的多路復用技術。而用于基因表達分析的分子條形碼掃描就是這樣一種技術，利用核酸雜交來識別DNA和RNA分子標靶，并將其作為產生熒光染料順序排列的模版。

圖4. 用于基因表達分析的分子條形碼掃描。掃描儀配有激發和發射濾光片，可區分由藍色、綠色、黃色和紅色圓圈代表的 4 種染料，可讀取探針位置 1 至 6 的熒光信號，以揭示雜交核酸靶標的編碼身份。

以分子條形碼掃描為出發點的MERFISH (多重誤差魯棒熒光原位雜交)是一種高度多重化的單分子成像技術，能夠同時測量單個細胞中數百至數千個目標 RNA 種類的拷貝數和空間分布。首先將編碼的寡核苷酸探針和目標RNA雜交，并依次添加熒光染料標記的讀取核苷酸探針。這些讀取探針會在單分子級別上被空間定位，然后被熄滅。讀取探針必須僅與編碼探針雜交，而不能與細胞核酸發生雜交。通過連續的成像周期積累編碼探針的身份，如果編碼探針通過讀取探針的雜交被檢測到，則賦予二進制位值“1”，如果沒有檢測到，則賦予“0”。原則上，需要 12 個雜交+成像周期來識別 4095（212-1）個獨特的編碼探針。實際上，二進制編碼空間較少，以盡量減少假陰性（1>0）和假陽性（0>1）調用錯誤以及隨之而來的靶標 RNA 錯誤識別。例如，已經證明可以使用 69 位條形碼識別 10,050 個 RNA 靶標。

對于MERFISH應用，需要高強度、空間均勻的照明場，并且與典型sCMOS相機傳感器的尺寸（~200mm2）相匹配。為了滿足此要求，需要在顯微鏡中安裝專業的臨界照明器。Lumencor的CELESTA光引擎很好地滿足了這些需求，通過光纖輸出耦合到顯微鏡中，通過高數值孔徑的高放大倍數物鏡在樣品平面上提供1-10W/mm2。

圖5. 為MERFISH多路單分子成像優化的CELESTA激光光引擎輸出光譜。

顯然，對于那些超出簡單光譜分辨能力的高并行熒光標記生物分析，可以通過精心選擇熒光團、光學濾光片、精細調節激發照明和智能算法來實現。巧妙的標記策略，如分子條形碼，也可以應用于廣泛的生物樣本，以增強來自高度復雜組織標本的生物分子信息的光譜分辨和空間分布。在此，我們講述了一種大規模并行單分子成像技術，MERFISH，利用重復標記協議來最大化單細胞中數十萬個RNA靶標的拷貝數量和空間分布信息。檢索大量數據集的技術和機會對于當今豐富的基因組和轉錄組信息生物分析至關重要。實驗者必須在有限的波長范圍內進行光譜解析，以充分利用光譜寬度、光譜純度和熒光團兼容性，以實現激發和發射之間的最佳區分。策略性的重復成像，輔以純凈、明亮、穩定的照明和高質量的光學玻璃，能夠實現高度多重化的結果，并克服了在可用可見波長內定義的歷史限制。