微流控技術(shù)是一種通過(guò)微小的通道和微型裝置對(duì)流體進(jìn)行精確操控和分析的技術(shù)。它是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)發(fā)展過(guò)程中的一種重要的生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)，具有廣泛的應(yīng)用前景和重要性。它在高通量分析、個(gè)性化醫(yī)療、細(xì)胞篩選等方面有著巨大的潛力，Aigtek安泰電子今天就將為大家分享一篇微流控領(lǐng)域研究成果，一起接著往下看吧~

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）來(lái)源的心肌組織（hiPSC-CM），是一種極具潛力且可減少藥物研發(fā)中動(dòng)物測(cè)試的體外組織模型。然而傳統(tǒng)基于生化因子定向誘導(dǎo)分化所得的心肌組織，其不成熟的特性卻顯著影響了該類(lèi)組織的實(shí)際應(yīng)用。來(lái)自加州大學(xué)伯克利分校的KevinE.Healy團(tuán)隊(duì)通過(guò)在微流控芯片內(nèi)部有機(jī)結(jié)合組織工程手段和培養(yǎng)體系優(yōu)化的方式，大大提高了hiPSC來(lái)源心肌組織的成熟度，且這些誘導(dǎo)細(xì)胞成熟的因素對(duì)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位和鈣離子調(diào)控的影響具有表型依賴(lài)性。相關(guān)論文“Metabolicallydrivenmaturationofhuman-induced-pluripotent-stem-cell-derivedcardiacmicrotissuesonmicrofluidicchips”發(fā)表于雜志NatureBiomedicalEngineering。

基于已有的研究報(bào)道，研究者猜想將組織工程手段與可溶性因子優(yōu)化進(jìn)行結(jié)合，將有望提高現(xiàn)有hiPSC-CM的成熟度。為此，研究者首先在微流控芯片中建立了大小不同、特異性排列的微柱陣列，以作為心肌細(xì)胞的附著位點(diǎn)，從而促進(jìn)多層組織自組裝的一致性，并實(shí)現(xiàn)心肌組織的肌節(jié)排列和單軸跳動(dòng)（圖1）。隨后，研究者將同源的hiPSC-CM和基質(zhì)細(xì)胞（hiPSC-SC）在上述芯片微生理系統(tǒng)（MPS）中進(jìn)行共培養(yǎng)，并探索了葡萄糖、油酸、棕櫚酸和白蛋白（這里選用BSA）等不同碳源對(duì)心肌組織成熟度的影響。在10天的培養(yǎng)過(guò)程中，研究者通過(guò)對(duì)心肌組織的跳動(dòng)現(xiàn)象和鈣通量表征，最終確認(rèn)同時(shí)存在油酸和棕櫚酸兩類(lèi)脂肪酸、降低葡萄糖含量、提高BSA含量的新型成熟培養(yǎng)基（MM）為最佳促成熟組合。

圖1優(yōu)化的hiPSC來(lái)源心肌微生理系統(tǒng)

在完成微流控芯片的構(gòu)建和碳源優(yōu)化后，研究者基于WTC（野生C型）hiPSC建立了心肌微生理系統(tǒng)，并對(duì)MM引起的心肌鈣瞬變和動(dòng)作電位變化進(jìn)行了系統(tǒng)的表征。結(jié)果表明，MM有效縮短了心肌微生理系統(tǒng)中的心肌動(dòng)作電位時(shí)程（APD），并提高了基線(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的鈣振幅；但同樣的測(cè)試在2D培養(yǎng)的心肌組織中無(wú)明顯變化。接著，研究者利用WTC和SCVI20（斯坦福大學(xué)心血管生物庫(kù)細(xì)胞系20）兩類(lèi)hiPSC來(lái)源的心肌組織，探究了MM對(duì)不同基因型細(xì)胞作用的差異。從動(dòng)作電位的角度看，SCVI20心肌組織的初始APD更短，但隨著培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到10天，該類(lèi)組織的APD與WTC心肌和原代成人心肌逐漸趨同；從鈣離子通量的角度看，SCVI20心肌組織與WTC組織具有類(lèi)似的變化趨勢(shì)，但其最大鈣離子上升速度提升更明顯（圖2）。這也初步說(shuō)明了微流控芯片中的3D培養(yǎng)環(huán)境和優(yōu)化的MM對(duì)心肌組織動(dòng)作電位和鈣瞬變的影響具有協(xié)同效應(yīng)，且這種影響具有基因型的特異性。

圖2成熟心肌MPS的動(dòng)作電位表征

隨后，研究者探究了MM對(duì)心肌組織中線(xiàn)粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。基于熒光表征不難發(fā)現(xiàn)，不同hiPSC來(lái)源的心肌組織，其中線(xiàn)粒體內(nèi)跨膜電位都有顯著上調(diào)，提示MM培養(yǎng)基處理后的心肌MPS中氧化磷酸化現(xiàn)象明顯增加。另外，盡管線(xiàn)粒體的密度沒(méi)有明顯變化，但MM的處理使其排布更加規(guī)則，并使線(xiàn)粒體延伸出更多絲狀物從而形成網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)然，在2D培養(yǎng)的心肌組織中，未發(fā)現(xiàn)上述變化（圖3）。這些數(shù)據(jù)可以說(shuō)明，優(yōu)化后的MM培養(yǎng)基在心肌MPS中有效改變了細(xì)胞中線(xiàn)粒體的狀態(tài)，使心肌組織處于更趨向于成熟態(tài)的代謝表型。

圖3MM處理心肌MPS后的線(xiàn)粒體形態(tài)學(xué)變化

接著，研究者觀測(cè)了心肌微生理系統(tǒng)中的力學(xué)效應(yīng)。首先，僅從肌節(jié)形態(tài)和排布來(lái)看，MM的處理在WTC和SCVI20來(lái)源心肌中都不會(huì)產(chǎn)生顯著影響。將微流控芯片中微柱的形變轉(zhuǎn)化為受力的大小，可以發(fā)現(xiàn)：在高濃度鈣離子的刺激下，MM處理組和常規(guī)培養(yǎng)基組的心肌組織施力效果相近。然而MM處理后的WTC心肌組織卻表現(xiàn)出對(duì)低濃度鈣刺激更敏感的效應(yīng)。同時(shí)，在一定范圍內(nèi)MM處理的心肌MPS會(huì)對(duì)鈣離子濃度變化響應(yīng)更為劇烈。當(dāng)在心肌MPS中施加異丙腎上腺素這一誘因時(shí)，WTC和SCVI20來(lái)源的心肌組織分別表現(xiàn)為輕微的響應(yīng)遲鈍或敏感；而時(shí)序性改變異丙腎上腺素的刺激時(shí)，兩類(lèi)心肌組織則都表現(xiàn)為響應(yīng)更為遲鈍（圖4）。總體來(lái)看，這些數(shù)據(jù)表明MM的處理不會(huì)損害肌節(jié)或干擾興奮-收縮耦合及受體反應(yīng)性；但在細(xì)胞外鈣的含量受限時(shí)，MM處理則會(huì)增強(qiáng)鈣收縮耦合。

圖4MM處理后心肌MPS的變力響應(yīng)

在接下來(lái)的部分，研究者從基因表達(dá)的角度表征了MM處理后心肌MPS的變化。結(jié)果表明，MM的處理并不會(huì)顯著改變WTC和SCVI20心肌組織中電生理學(xué)、細(xì)胞特性、收縮性和鈣調(diào)控相關(guān)的基因表達(dá)。但在WTC心肌組織中，肌脂蛋白和鈣離子通道相關(guān)的基因（SLN、HCN2和CACNB2）表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì)，而與鉀離子通道和乙醛脫氫酶相關(guān)的基因（KCND2和ALDH1A1）表達(dá)則有下調(diào)趨勢(shì)。對(duì)SCVI20心肌組織來(lái)說(shuō)，與鉀離子通道相關(guān)的KCNJ2和KCND2基因分別出現(xiàn)了顯著的下調(diào)和上調(diào)；而與肌脂蛋白和鈣離子通道相關(guān)的基因（SLNCACNB2）則只有輕微的上調(diào)。同樣地，很難在2D培養(yǎng)的心肌組織中發(fā)現(xiàn)這些較為顯著的變化（圖5）。

圖5脂基MM處理單層心肌組織和MPS后的基因表達(dá)分析

從上述結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，MM的處理在WTC和SCVI20來(lái)源心肌MPS中產(chǎn)生了對(duì)APD相反的影響，但其最終結(jié)果是使兩者的APD和鈣調(diào)控行為都接近于原代生理組織。當(dāng)然，這并不意味著兩類(lèi)心肌細(xì)胞內(nèi)的電流值相近，而電流值又直接影響了心肌組織的藥學(xué)響應(yīng)等，因而對(duì)細(xì)胞內(nèi)電流的測(cè)定是一個(gè)不可忽視的問(wèn)題。受限于活細(xì)胞很難從心肌MPS中取出的問(wèn)題，研究者創(chuàng)造性地采用了計(jì)算模擬的方式：由APD和鈣離子變化的數(shù)據(jù)來(lái)推算細(xì)胞內(nèi)的電流值。模擬預(yù)測(cè)的結(jié)果表明，MM的處理對(duì)WTC和SCVI20心肌組織中動(dòng)作電位的改變和鈣調(diào)控影響的數(shù)值不同，但兩種來(lái)源細(xì)胞的成熟表型卻非常相似。

圖6單一電流和鈣離子調(diào)控對(duì)單層心肌組織和MPS動(dòng)作電位影響的數(shù)學(xué)模型

最后，研究者將不同來(lái)源的心肌微生理系統(tǒng)用于藥效學(xué)研究，以證明該體外模型的實(shí)用價(jià)值。文中選用了維拉帕米（Verapamil）、氟卡尼（Flecainide）和阿夫唑嗪（Alfuzosin）等幾類(lèi)可改善心律不齊的臨床藥物進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明，盡管WTC和SCVI20心肌組織對(duì)不同藥物的具體反應(yīng)不同，但總體上，在心肌MPS中使用MM培養(yǎng)的組織，能有效減少假陽(yáng)性(維拉帕米)和假陰性(阿夫唑嗪)藥物反應(yīng)的預(yù)估（圖7）。這進(jìn)一步證明了該成熟化的微生理系統(tǒng)在藥物評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)方面的優(yōu)勢(shì)。

圖7成熟的WTC心肌MPS中抗心律失常藥的藥理學(xué)研究

總而言之，本文證明了在MPS中使用基于脂肪酸的培養(yǎng)基進(jìn)行干細(xì)胞來(lái)源心肌組織的3D培養(yǎng)，可以有效促進(jìn)hiPSC-CM動(dòng)作電位的成熟。且所得心肌組織的APD和鈣瞬變行為會(huì)更接近于原代生理組織。同時(shí)，這種變化是可以經(jīng)過(guò)一定的理論模擬來(lái)進(jìn)行判定和預(yù)測(cè)。而這種較為成熟的心肌組織也有望為相關(guān)治療藥物的研發(fā)和藥物安全性測(cè)試提供更好的先決條件。

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審核編輯 黃宇