GeIMA生物墨水打印的耳朵

GeIMA生物墨水打印的器官

生物3D打印，就如同切土豆的逆過程，即將土豆片、土豆絲、土豆丁及土豆泥反向組裝成土豆。然而，組裝出的土豆內(nèi)的細(xì)胞雖然有很好的活性，但這樣的土豆種到地里卻很難直接發(fā)芽（打印出的器官與體內(nèi)器官從功能上來說還有較大的差距），這種“形似而神不似”的問題正是當(dāng)下生物3D打印面臨的瓶頸之一。

據(jù)記者了解，要想打印出既在外形結(jié)構(gòu)上相似，結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞又具有協(xié)同功能的組織器官并非易事。這不僅需要開發(fā)合適的活性“生物墨水”，還需要一臺(tái)能夠精準(zhǔn)操控的3D打印設(shè)備。

近日，浙江大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院教授賀永帶領(lǐng)的課題組發(fā)明了一種新型生物3D打印方法，該方法能夠操控細(xì)胞形成特定結(jié)構(gòu)的微球或微纖維，進(jìn)而長成具有生物活性的微組織。相關(guān)論文先后刊登在SMALL雜志上。

不過，賀永對《中國科學(xué)報(bào)》記者坦言，很多人認(rèn)為生物3D打印已經(jīng)無所不能，甚至覺得很快就可打印心肝腎肺等器官，實(shí)現(xiàn)器官移植，然而，事實(shí)上生物3D打印還遠(yuǎn)未達(dá)到我們最初器官打印的設(shè)想，體外打印能夠用于移植的活性器官還有相當(dāng)長的路要走。目前的生物3D打印，有兩個(gè)重要應(yīng)用，其一是構(gòu)造人體器官模型，從而為疾病機(jī)理研究、腫瘤的個(gè)性化治療等提供更為高效的手段；其二是為器官/組織的局部缺損、功能喪失等提供更高效的修復(fù)手段。

為體外重建器官提供新思路

生物3D打印也叫細(xì)胞打印，是指操縱細(xì)胞“生物墨水”構(gòu)造活性結(jié)構(gòu)的過程，而開發(fā)合適的生物墨水一直是生物3D打印中的一個(gè)核心問題。

賀永告訴記者，“生物墨水”首先要具備非常好的生物活性、類似體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，便于打印后的細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育，并建立細(xì)胞彼此間的通信。另外，在打印過程中還要求“生物墨水”必須具有很好的流動(dòng)性，打印后能很快固化以便于固定成型。

甲基丙烯酸化水凝膠（GelMA）就是一種光敏性生物水凝膠，兼?zhèn)漭^強(qiáng)的可加工性和生物相容性，是組織工程、生物醫(yī)學(xué)、生物制造等領(lǐng)域的熱門材料。不過，GelMA的固化時(shí)間稍長（約3~5秒），同時(shí)載細(xì)胞的GelMA黏度較低，導(dǎo)致其直接制造難度較大。賀永教授課題組多年從事生物3D打印研究，已成功實(shí)現(xiàn)GelMA“生物墨水”及生物3D打印機(jī)的產(chǎn)業(yè)化。

“如果能高效實(shí)現(xiàn)GelMA微纖維的制造，就有望發(fā)展出基于微纖維的迷你組織。”受到旋繩效應(yīng)的啟發(fā)，賀永課題組開發(fā)出了一種同軸生物打印技術(shù)。通過該技術(shù)，賀永課題組打印出包裹人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的直血管和螺旋血管迷你組織，細(xì)胞在GelMA里可以增殖伸展并遷移。有趣的是，隨著培養(yǎng)時(shí)間的加長，內(nèi)皮細(xì)胞還遷移到了GelMA纖維外壁，并建立連接形成類似血管的內(nèi)皮管腔。

此外，賀永課題組還致力于構(gòu)建基于微球的迷你組織，他們將不同的細(xì)胞制成“生物墨水”，在一個(gè)微流控芯片噴頭的控制下，一點(diǎn)點(diǎn)“吐”出“墨水”。“在一股微氣流的吹動(dòng)下，噴頭吐出的液滴不會(huì)馬上落下，而是旋轉(zhuǎn)起來，此時(shí)再根據(jù)數(shù)學(xué)建模控制不同組分‘生物墨水’下降的方向，就能形成精致的立體結(jié)構(gòu)。”賀永說，“這個(gè)過程有點(diǎn)像在轉(zhuǎn)動(dòng)的蛋糕模具上裱花，讓不同細(xì)胞形成特定的立體‘編隊(duì)’。”賀永課題組用兩種分別混合了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的“生物墨水”，同步打印出了螺旋形的微球，經(jīng)過幾天實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)便形成了骨類器官。不僅如此，他們還在微球內(nèi)制造出螺旋面、玫瑰花、太極等復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)。

“這一技術(shù)的精度可以達(dá)到單細(xì)胞分辨率。”賀永說，與現(xiàn)有生物制造方法相比，其特點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)了在微小空間內(nèi)三維結(jié)構(gòu)的可控成型，為體外重建類器官、開發(fā)更為高效的器官芯片、實(shí)施更有效的細(xì)胞治療等，提供有效路徑。

主攻解決“神似”問題

目前，生物3D技術(shù)已經(jīng)從傳統(tǒng)僅注重結(jié)構(gòu)和形狀的制造，拓展到構(gòu)建體外細(xì)胞結(jié)構(gòu)體和生物裝置，并應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)和藥物檢測模型，以及基于細(xì)胞和微流體裝置的細(xì)胞、組織、器官等高級生物和醫(yī)療器械產(chǎn)品。

此前在2018中國增材制造大會(huì)上，清華大學(xué)生物制造中心主任孫偉對《中國科學(xué)報(bào)》記者表示，細(xì)胞打印最關(guān)注三個(gè)問題：第一能不能打印；第二打印后能不能成型，不能形成孔結(jié)構(gòu)就沒有辦法把營養(yǎng)液放進(jìn)去，打印結(jié)構(gòu)內(nèi)部細(xì)胞就會(huì)死；第三把細(xì)胞活著打印出來之后，細(xì)胞能不能具有功能。

“生物3D打印的關(guān)鍵就是要注意選擇什么樣的噴頭、材料、黏稠度，才能使得這個(gè)細(xì)胞打出來后，至少保證90%以上的成活率。”孫偉說，他們課題組就利用明膠和海藻酸鈉組合成“生物墨水”進(jìn)行打印，這種“生物墨水”具有可以隨溫度而變化的趨勢，能夠通過調(diào)控溫度使得“生物墨水”在打印時(shí)延遲性最小。

實(shí)際上，清華大學(xué)從上世紀(jì)90年代末就開始從事生物3D打印的研究，清華大學(xué)生物制造中心教授徐弢還將生物3D打印應(yīng)用在了神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域。在生物3D打印神經(jīng)鞘管方面，他們團(tuán)隊(duì)利用制造學(xué)的優(yōu)勢，通過打印微孔多通道結(jié)構(gòu)的神經(jīng)導(dǎo)管，在早期進(jìn)行神經(jīng)生長因子灌注。植入3個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，與未灌注神經(jīng)生長因子的神經(jīng)導(dǎo)管相比，灌注有神經(jīng)生長因子的神經(jīng)導(dǎo)管具有更好的促進(jìn)組織再生的能力。

為了使得生物3D 打印的成果更加仿生，徐弢團(tuán)隊(duì)還采用了“同軸打印+納米膜制造神經(jīng)纖維束”的方法，把神經(jīng)干細(xì)胞做成像線一樣的細(xì)胞線，線的中心是神經(jīng)干細(xì)胞，周圍包裹著的則是神經(jīng)的支撐細(xì)胞，這些細(xì)胞不斷地產(chǎn)生著營養(yǎng)因子。

“同軸打印的方式，即在中心打印神經(jīng)干細(xì)胞，在周邊打印支撐細(xì)胞，最終以條索狀的形式打印出來，然后將條索包裹起來。”徐弢表示，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這種狀態(tài)下纖維束細(xì)胞的存活率相當(dāng)高，而且也在一定程度上釋放出了神經(jīng)生長因子。

在賀永看來，生物3D打印的發(fā)展就是要解決“形似而神不似”的問題，實(shí)現(xiàn)生物3D打印的功能化突破和應(yīng)用。打印結(jié)構(gòu)后續(xù)的功能化是評價(jià)打印性能的金標(biāo)準(zhǔn)，也是生物3D打印的最終目的。

解決器官移植仍需時(shí)日

賀永告訴記者，細(xì)胞被水凝膠包裹的狀態(tài)，就如同果凍里面有一堆的水果丁，打印過程中，如果機(jī)械力、溫度等工藝控制不好，都會(huì)對細(xì)胞造成損傷。不過，目前生物3D打印的工藝已經(jīng)非常穩(wěn)定，細(xì)胞存活率基本都可以達(dá)到90%以上。

不過，他也同時(shí)指出，生物3D打印目前還只能打印一些比較簡單的組織，比如皮膚、血管等，要想實(shí)現(xiàn)打印出的肝臟等復(fù)雜器官同樣“神似”，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜器官的全功能重建，至少還需要數(shù)十年的時(shí)間。

北京大學(xué)第三醫(yī)院教授余家闊也表示，雖然2015年3D打印的腎臟組織成功問世，但也僅是供醫(yī)學(xué)研究使用，不能真正應(yīng)用于器官移植，因?yàn)槠浒踩院蛯?shí)用性還有待探究，3D打印的器官在植入人體前還需經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)與數(shù)據(jù)分析。

余家闊認(rèn)為，3D打印器官存在的困難主要包括打印材料以及細(xì)胞太過微小與脆弱，以及植入人體后能否自然銜接融合同時(shí)不產(chǎn)生排異反應(yīng)。他覺得，未來3D打印器官的趨勢將是以可吸收性生物材料作為載體、以細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)，在體外構(gòu)成組織保護(hù)細(xì)胞。對于人體器官也將在研究其營養(yǎng)供應(yīng)與代謝的基礎(chǔ)上，解決經(jīng)3D打印技術(shù)培養(yǎng)出的組織體植入問題。

徐弢則表示，未來生物3D打印技術(shù)發(fā)展的機(jī)會(huì)越來越多，只有更多地與醫(yī)療、臨床和基礎(chǔ)科學(xué)相結(jié)合，才能形成多贏的局面。