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分子診斷IVD設(shè)備的發(fā)展史

MEMS ? 來源:YXQ ? 2019-07-08 16:34 ? 次閱讀

在剛剛過去的蘇州標(biāo)記免疫分析專業(yè)委員會2019學(xué)術(shù)峰會上,浙江清華長三角研究院分析測試中心蔡強(qiáng)主任詳細(xì)講述了分子診斷IVD設(shè)備的發(fā)展史。

蔡強(qiáng):研究員、浙江清華長三角研究院分析測試中心主任、國家食品安全風(fēng)險評估中心應(yīng)用技術(shù)合作中心副主任

分子診斷在體外診斷中的位置

分子診斷在臨床診斷中的技術(shù)主要包括PCR技術(shù)、芯片技術(shù)和測序技術(shù)。臨床檢測中,分子診斷越來越受到重視,但市場占比與生化診斷、免疫診斷相比,還存在一定的差距。

目前分子診斷在體外診斷中的主要的應(yīng)用領(lǐng)域,包括對病毒、細(xì)菌等微生物的篩查及定性定量檢測,藥物篩選及用藥分析以及基因早期的分析。在微生物檢驗檢測方面,分子診斷相對于免疫診斷具有一定的優(yōu)勢;基因圖譜分析方面,雖然目前相關(guān)研究很多,但在該領(lǐng)域應(yīng)用的臨床價值還有待發(fā)掘。

分子診斷在體外診斷中的位置

分子診斷和微生物診斷存在一定的關(guān)聯(lián)性,微生物診斷是外部特性分析,而分子診斷則是對內(nèi)部分子的檢測。

表1 分子診斷在體外診斷中的位置

分子診斷主要技術(shù)發(fā)展的時間軸

早期的分子診斷設(shè)備,多為大型集成化設(shè)備,包含很多的操作模塊。在原理上,早期的設(shè)備并無很多創(chuàng)新,主要是將多種手工操作內(nèi)容自動化和集成化,發(fā)展到基因芯片,才有了原理性的突破。1990年提出的人類基因組計劃、后來的蛋白組學(xué)以及從近期開始的微生物組計劃,極大的推動了分子診斷設(shè)備的發(fā)展。產(chǎn)品方面,較早期時有Affymetrix公司推出的第一塊商業(yè)化基因芯片。

接下來是PCR儀器的發(fā)展。早期的PCR儀器,是簡單的DNA解鏈、復(fù)制、復(fù)性等過程,除了水浴鍋自動化,并沒有太多技術(shù)含量。數(shù)字PCR技術(shù)出現(xiàn)后, 與生物信息學(xué)和微型加工技術(shù)關(guān)聯(lián)起來,發(fā)展速度很快。再后來出現(xiàn)了微流控技術(shù)和基因測序技術(shù)。基因測序技術(shù)經(jīng)歷了一代、二代、三代,目前測序技術(shù),仍然是重要的發(fā)展方向。

分子診斷主要技術(shù)發(fā)展的時間軸

前處理復(fù)雜導(dǎo)致分子診斷的現(xiàn)場應(yīng)用成為瓶頸

分子診斷和免疫診斷、生化診斷設(shè)備不同的地方,很大程度在于樣品前處理。免疫檢測對象主要是一些游離的大分子,處理相對容易,但分子診斷樣本處在細(xì)胞當(dāng)中,處理過程容易被污染,因此前處理系統(tǒng)相對復(fù)雜。

分子診斷系統(tǒng)的組成包括樣本前處理系統(tǒng)、檢測處理系統(tǒng)和分析處理系統(tǒng)。樣本前處理系統(tǒng)依據(jù)其功能的豐富程度又包括移液操作和核酸提取兩個平臺,依據(jù)使用場所不同分為實驗室自動化平臺和現(xiàn)場前處理平臺。

目前前處理設(shè)備中,全自動的移液工作站是比較成功的設(shè)備。它是一種全自動、高精度移液系統(tǒng),專門用于小體積的PCR、qPCR體系配置,能夠完全替代手工,保證了配置實驗擴(kuò)增體系的正確性、精密度及重復(fù)性。缺點是功能單一,臨床及科研應(yīng)用尚有一定局限性。

貝克曼自動化工作站Biomek i7

核酸提取設(shè)備,主要是自動核酸提取儀,該儀器集成了自動移液工作站和標(biāo)準(zhǔn)耗材,在以其預(yù)設(shè)程序控制下進(jìn)行核算分離的儀器,這一類自動化系統(tǒng)在科研和臨床中應(yīng)用最為廣泛。提取方法的核心是免疫磁珠,包括磁珠吸附和磁珠分離等。除磁珠提取純化方法外,還有其他純化方法,如柱層析法。

托摩根核酸提取儀 MM96

目前,現(xiàn)場分子診斷還存在諸多問題。免疫檢測中可用試紙條等材料,檢測方便,但是分子診斷沒有這類材料可用,主要原因是樣品前處理無法達(dá)到這種檢測目的。當(dāng)現(xiàn)場檢測時,在很開放的環(huán)境下,如何提取純化DNA,目前仍沒有簡易方法。現(xiàn)場檢測的需求,目前在醫(yī)院的臨檢中心還不大,對于基層的衛(wèi)生所,或許會存在這樣的需求,從這個問題也引發(fā)出醫(yī)療模式應(yīng)該往什么方向發(fā)展的思考。

分子診斷的三大檢測平臺

分子診斷主要的檢測平臺為PCR儀、芯片系統(tǒng)以及基因測序平臺。

PCR儀——數(shù)字PCR是未來發(fā)展趨勢

分子診斷設(shè)備另一個重要的組成內(nèi)容是PCR儀器。常規(guī)的PCR目前技術(shù)上可提升的空間很有限,但很多部件只有少數(shù)幾家廠家做的不錯。

熒光定量PCR,國內(nèi)有很多廠家生產(chǎn),技術(shù)、元器件等各方面正在迅速趕超國外儀器廠商水平,但這未必是國內(nèi)廠商最終的發(fā)展方向。得益于光源及檢測器件小型化趨勢,現(xiàn)在的熒光PCR儀越來越小型化。

數(shù)字PCR是PCR領(lǐng)域未來發(fā)展的趨勢,目前有一些廠商在研究生產(chǎn),比如銳訊生物、新羿生物、領(lǐng)航基因等。現(xiàn)在數(shù)字PCR的售價很高,主要原因是后端檢測器件靈敏度要求高,成像器件技術(shù)先進(jìn),造成成本偏高。當(dāng)然,因為數(shù)字PCR有絕對定量的功能,對于分子檢測意義重

微滴式數(shù)字PCR的檢測流程

表2 3種PCR的比較

DNA微陣列——基因芯片

熒光原位雜交(FISH),是一種傳統(tǒng)方法,對于原位切片的分析有一定的意義。儀器本身比較簡單,就是熒光顯微鏡,外加一個殼構(gòu)成的一個圖像分析儀。檢測過程是在一定的溫度下將切片加入設(shè)備中,成像。雜交的另一種方式是利用芯片進(jìn)行,主要是DNA微陣列芯片。芯片技術(shù)從上世紀(jì)90初期開始研究到現(xiàn)在,已經(jīng)有近三十年時間,目前已經(jīng)應(yīng)用到診斷當(dāng)中,用做疾病篩查。熒光原位雜交最核心的地方在于診斷試劑而非設(shè)備。目前的檢測方式主要采用熒光標(biāo)記的方式,在靈敏度方面,已經(jīng)能夠滿足檢測要求,因此化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記方式相對較少。

美谷分子GenePix 4300A&4400A微陣列基因芯片掃描儀

第四代基因測序成為資本追逐熱點

基因測序的發(fā)展,從最早獲得諾貝爾獎的一代,到現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到第四代。原理上,第一代測序儀可認(rèn)為是人工操作方法的儀器實現(xiàn),相對比較簡單。現(xiàn)在的第三代測序和第四代測序的原理已有一定區(qū)別。目前,高通量測序的需求很大,發(fā)展很迅速,國內(nèi)在基因測序儀器的發(fā)展也將會越來越快。第三代和四代測序儀的價值在于直接讀取功能大,但成本很高,測序時間長。把測序降到10美元以下是全球相關(guān)企業(yè)追求的目標(biāo),如果實現(xiàn),測序在診斷中的應(yīng)用將會更多的取代其他技術(shù)。

四代測序,即納米孔技術(shù)測序,目前已經(jīng)成為資本市場追逐的熱點,容量約為幾十億美元。原理很簡單,就是DNA鏈打開后穿過一個很細(xì)的孔,單個堿基對通過納米尺寸的通道時,會引起通道點穴性能的變化。四代測序具有高讀長、易集成、小型化、高速度、大通量等優(yōu)勢。納米孔所通電流很小,為10-18-10-15A,遠(yuǎn)低于熒光檢測電流,所以目前檢測時間大約需要幾個小時到十幾個小時,隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步,后期有望將測序時間縮短到半小時。

納米孔主要包括兩大類生物納米孔和固態(tài)納米孔。生物大分子納米孔發(fā)展較早,已經(jīng)有了相應(yīng)的設(shè)備,體積很小,準(zhǔn)確率較低。固態(tài)納米孔,目前還是實驗室水平,有少數(shù)四代測序公司已經(jīng)開始做固態(tài)納米孔測序儀。固態(tài)納米孔的檢測方式很多,在基底上做一些材料摻雜,具有半導(dǎo)體特性,可替代光學(xué)器件,精確度也等性能指標(biāo)更好。因為固態(tài)納米孔使用的是標(biāo)準(zhǔn)的微電子工藝,如果可以規(guī)模化生產(chǎn),可以降低測序儀生產(chǎn)成本,值得推廣。

測序結(jié)束后,數(shù)據(jù)處理比其他診斷方法更為復(fù)雜。免疫檢測的IVD設(shè)備后期用到的主要是數(shù)據(jù)庫管理,無需數(shù)據(jù)處理,但是分子診斷數(shù)據(jù)需要用算法進(jìn)行處理,這些算法也就是生物信息學(xué)的發(fā)展源頭。目前來講,做算法的人才和做軟件的人才都并不缺乏,缺乏的是能夠?qū)⑺惴ㄗ龀绍浖娜瞬牛@是基本事實。目前很多高校已經(jīng)發(fā)表了很多算法相關(guān)的論文,但是軟件依舊很少。目前很多檢測機(jī)構(gòu)所用的數(shù)據(jù)分析軟件多是英文軟件,很多還是開源軟件,這種軟件不適合醫(yī)院檢驗使用。因此,數(shù)據(jù)處理軟件不足,對測序設(shè)備在臨床的應(yīng)用是個非常棘手的問題。

除了上述測序技術(shù),DNA條形碼與測序結(jié)合起來,未來在臨床上或可發(fā)揮一定的作用。DNA條形碼是利用標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增、較短的DNA片段在物種內(nèi)的的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識別系統(tǒng)。目前主要用于物種鑒定。

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原文標(biāo)題:分子診斷設(shè)備發(fā)展史:精細(xì)加工與芯片系統(tǒng)走上歷史舞臺,國產(chǎn)設(shè)備需早作準(zhǔn)備

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