1　基因芯片概述

　　隨著人類基因組計劃( Human Genome Project)即全部核苷酸測序的即將完成，人類基因組研究的重心逐漸進入后基因組時代（ Postgenome Era）向基因的功能及基因的多樣性傾斜。通過對個體在不同生長發育階段或不同生理狀態下大量基因表達的平行分析，研究相應基因在生物體內的功能，闡明不同層次多基因協同作用的機理，進而在人類重大疾病如癌癥、心血管疾病的發病機理、診斷治療、藥物開發等方面的研究發揮巨大的作用。它將大大推動人類結構基因組及功能基因組的各項基因組研究計劃。

　　基因芯片的工作原理與經典的核酸分子雜交方法（southern 、northern）是一致的，都是應用已知核酸序列作為探針與互補的靶核苷酸序列雜交，通過隨后的信號檢測進行定性與定量分析，基因芯片在一微小的基片（硅片、玻片、塑料片等）表面集成了大量的分子識別探針，能夠在同一時間內平行分析大量的基因，進行大信息量的篩選與檢測分析。基因芯片主要技術流程包括：芯片的設計與制備；靶基因的標記；芯片雜交與雜交信號檢測。

　　基因芯片的設計實際上是指芯片上核酸探針序列的選擇以及排布，設計方法取決于其應用目的，目前的應用范圍主要包括基因表達和轉錄圖譜分析及靶序列中單堿基多態位點（single nucleoTIde polymorphism，SNP）或突變點的檢測，表達型芯片的目的是在雜交實驗中對多個不同狀態樣品(不同組織或不同發育階段、不同藥物刺激)中數千基因的表達差異進行定量檢測，探針序列一般來自于已知基因的cDNA 或EST庫，設計時序列的特異性應放在首要位置，以保證與待測目的基因的特異結合，對于同一目的基因可設計多個序列不相重復的探針，使最終的數據更為可靠。基因單堿基多態檢測的芯片一般采用等長移位設計法，即按靶序列從頭到尾依次取一定長度的互補的核苷酸序列形成一探針組合，這組探針是與靶序列完全匹配的野生型探針，然后對于每一野生型探針，將其中間位置的某一堿基分別用其它三種堿基替換，形成三種不同的單堿基變化的核苷酸探針，這種設計可以對某一段核酸序列所有可能的SNPs位點進行掃描。

　　芯片制備方法主要包括兩種類型：(1)點樣法：首先是探針庫的制備, 根據基因芯片的分析目標從相關的基因數據庫中選取特異的序列進行PCR擴增或直接人工合成寡核苷酸序列，然后通過計算機控制的三坐標工作平臺用特殊的針頭和微噴頭分別把不同的探針溶液逐點分配在玻璃、尼龍以及其它固相基片表面的不同位點上，通過物理和化學的方法使之固定，該方法各技術環節均較成熟，且靈活性大，適合于研究單位根據需要自行制備點陣規模適中的基因芯片。(2)原位合成法：該法是在玻璃等硬質表面上直接合成寡核苷酸探針陣列，目前應用的主要有光去保護并行合成法，壓電打印合成法等，其關鍵是高空間分辨率的模板定位技術和高合成產率的DNA化學合成技術，適合制作大規模DNA探針芯片，實現高密度芯片的標準化和規模化生產。

　　待分析樣品的制備是基因芯片實驗流程的一個重要環節, 靶基因在與芯片探針結合雜交之前必需進行分離、擴增及標記。標記方法根據樣品來源、芯片類型和研究目的的不同而有所差異。通常是在待測樣品的PCR擴增、逆轉錄或體外轉錄過程中實現對靶基因的標記。對于檢測細胞內mRNA表達水平的芯片，一般需要從細胞和組織中提取RNA，進行逆轉錄，并加入偶聯有標記物的dNTP，從而完成對靶基因的標記過程，對于陣列密度較小的芯片可以用同位素，所需儀器均為實驗室常規使用設備，易于開展相關工作，但是在信號檢測時，一些雜交信號強的點陣容易產生光暈，干擾周圍信號的分析。高密度芯片的分析一般采用熒光素標記靶基因，通過適當內參的設置及對熒光信號強度的標化可對細胞內mRNA的表達進行定量檢測。近年來運用的多色熒光標記技術可更直觀地比較不同來源樣品的基因表達差異，即把不同來源的靶基因用不同激發波長的熒光素標記，并使它們同時與基因芯片雜交，通過比較芯片上不同波長熒光的分布圖獲得不同樣品間差異表達基因的圖譜，常用的雙色熒光試劑有Cy3- dNTP和Cy5- dNTP。對多態性和突變檢測型基因芯片采用多色熒光技術可以大大提高芯片的準確性和檢測范圍，例如用不同的熒光素分別標記靶序列及單堿基失配的參考序列，使它們同時與芯片雜交，通過不同熒光強弱的比較得出靶序列中堿基失配的信息。

　　基因芯片與靶基因的雜交過程與一般的分子雜交過程基本相同，雜交反應的條件要根據探針的長度、GC堿基含量及片的類型來優化，如用于基因表達檢測，雜交的嚴格性較低，而用于突變檢測的芯片的雜交溫度高，雜交時間短，條件相對嚴格。如果是用同位素標記靶基因，其后的信號檢測即是放射自顯影，若用熒光標記，則需要一套熒光掃描及分析系統，對相應探針陣列上的熒光強度進行分析比較，從而得到待測樣品的相應信息。由于基因芯片獲取的信息量大，對于基因芯片雜交數據的分析、處理、查詢、比較等需要一個標準的數據格式，目前，一個大型的基因芯片的數據庫正在構建中，將各實驗室獲得的基因芯片的結果集中起來，以利于數據的交流及結果的評估與分析。