原生質體分離與體細胞雜交

實驗準備：
配置并過濾滅菌2%的纖維素酶和0.4%果膠酶；蔗糖22%的原生質體漂浮培養基；原生質體培養基；FDA母液和工作液。

6.1 實驗目的
掌握植物細胞酶解去壁方法；原生質體活力鑒定的方法；了解細胞雜交的基本程序和方法。

6.2 原生質體分離
實驗材料：
煙草無菌苗葉片，煙草懸浮細胞系。
實驗操作：
A. 取生長3周的煙草無菌苗平展嫩葉，置于含有一薄層600mmol/L甘露醇-CPW溶液中，置于4℃黑暗下預處理6-8小時；懸浮細胞置于4℃黑暗下預處理48小時。
B. 預處理的葉片用吸管吸去預處理液，懸浮細胞離心轉入培養皿中，然后加入2％纖維素酶、0.4％果膠酶溶液，用封口膜將培養皿封嚴，置于暗處在24~26℃下保溫酶解；
C. 在倒置顯微鏡下觀察，細胞壁已降解，有圓球形原生質體釋放到溶液中，即終止酶解。用吸管輕輕壓擠，以釋放出全部原生質體；
D. 通過一個60~80μm的細胞篩過濾以除去較大的碎屑。濾液置于1個螺帽離心管中，在100g下離心3min，使原生質體沉降；
E. 棄取上清夜，將沉降物緩慢加入含有CPW配制的860mmol/L蔗糖溶液的螺帽離心管中，在在100g下離心10min；
F. 將蔗糖溶液的上部原生質體帶收集起來，并轉入到另一個離心管中。在離心管中加入原生質體培養基以使原生質體懸浮，在100g下離心3min，重復本相清洗過程至少3次；
G. 最后一次清洗之后，加入培養基調整原生質體密度至0.5×105到1×105/ml。將原生質體按講授的方法培養。

6.3 原生質體活力與密度測定
A．取一小指形管（已滅菌），加入1ml剛分離的原生質體懸浮液，再在其中加入1-2滴FDA工作液；
B．在血球計數板上滴一滴經FDA處理的原生質體懸浮液，置于熒光倒置顯微鏡下觀察。
C．根據發熒光細胞占總細胞的比例計算原生質體生活力，根據單位體積的細胞數計算細胞密度。

6.4 PEG誘導細胞體融合
A. 將上述分離的原生質體密度調整為4×105/ml的原生質體懸浮液備用；
B. 在1個60×15mm的培養皿中滴1滴（2~3ml）硅液200，然后在硅液上面放一張22×22mm的蓋片；
C. 將葉片原生質體和懸浮細胞原生質體等體積（一般各0.5ml）混合，然后用吸管吸取大約150μl原生質體懸浮液置于蓋玻片上。靜止大約5 min，以使原生質體沉降在蓋片上形成一個薄層；
D. 然后在原生質體懸浮液中，加入等體積的PEG溶液（50%PEG1540，10.5mmol/LCaCl2?2H2O，0.7mmol/LKH2PO4?H2O）。室溫（24℃）下，將PEG溶液中的原生質體保溫10~20 min.，在倒置顯微鏡下觀察原生質體粘連的情況；
E. 以5 min間隔輕輕加入2滴稀釋液（50 mmol/L甘氨酸，50mmol/LCaCl2?2H2O，300 mmol/L葡萄糖，pH9~10.5），保持5 min后，加入1滴原生質體培養基；
F. 用新鮮的原生質體培養基，以各為5 min的間隔，將原生質體清洗5遍，每次洗完之后，不要把蓋片上的培養基全部去掉，要在原生質體上留下一薄層舊培養基，而將新鮮培養基加于其上。此時可在倒置顯微鏡下，根據葉綠體標記統計異核融合率；
G. 洗滌完成后在蓋玻片上滴大約500μl原生質體培養基，在蓋玻片周圍以小滴形式再加入500~1000μl培養基，以保持培養皿內的濕度，封口后置于25℃黑暗條件下培養。

6.5 細胞電融合演示
通過實際操作，演示電融合的操作過程和細胞融合過程。